Variabilidade Genética na Medicina Forense

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Published on February 28, 2008

Author: VaniaCaldeira

Source: slideshare.net

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Apresentação sobre a Variabilidade Genética na Medicina Forense para a disciplina de BMC. Caso de estudo: investigação de uma violação.

A VARIABILIDADE GENÉTICA Biologia Molecular da Célula Trabalho elaborado por: Carolina Correia Cátia Barão Francisco Santos Vânia Caldeira NA MEDICINA FORENSE

Variabilidade Genética Meiose > Crossing-over (profase I) > Colocação de cada cromossomas de cada par de homólogos, de um lado ou outro do plano equatorial do fuso acromático é feita ao acaso (metafase I) Resulta de: mutações e recombinação génica durante a meiose e a fecundação: Fecundação

Meiose

> Crossing-over (profase I)

> Colocação de cada cromossomas de cada par de homólogos, de um lado ou outro do plano equatorial do fuso acromático é feita ao acaso (metafase I)

Resulta de: mutações e recombinação génica durante a meiose e a fecundação:

Fecundação

Medicina Legal e Forense Especialidade médica e jurídica Usa conhecimentos técnico-científicos de Medicina para o esclarecimento de factos de interesse da Justiça Reúne o estudo da Medicina, do Direito, da Biologia, da Química, da Balística, da Física, da Sociologia... Divide-se em várias áreas: > Antropologia forense > Traumatologia forense > Sexologia forense > Tanatologia…

Especialidade médica e jurídica

Usa conhecimentos técnico-científicos de Medicina para o esclarecimento de factos de interesse da Justiça

Reúne o estudo da Medicina, do Direito, da Biologia, da Química, da Balística, da Física, da Sociologia...

Divide-se em várias áreas:

> Antropologia forense

> Traumatologia forense

> Sexologia forense

> Tanatologia…

Variabilidade e Polimorfismos na Medicina Legal e Forense O objectivo da análise de DNA é diferenciar um indivíduo de outro pelo maior nº de características possível. Na espécie humana 10% do genoma codifica proteínas através do RNA, o restante são sequências repetitivas. É a variabilidade deste restante, ou seja, das regiões polimórficas, de função estrutural que se utiliza nos exames forenses de DNA.

O objectivo da análise de DNA é diferenciar um

indivíduo de outro pelo maior nº de características possível.

Na espécie humana 10% do genoma codifica proteínas através do RNA, o restante são sequências repetitivas.

É a variabilidade deste restante, ou seja, das regiões polimórficas, de função estrutural que se utiliza nos exames forenses de DNA.

Variabilidade e Polimorfismos na Medicina Legal e Forense Alelo - cada uma das variantes possíveis de um locus polimórfico. Locus – posição de um gene ou de um marcador genético num cromossoma. Tipos de polimorfismos: > SNPs > VNTRs > Polimorfismos de repetição de transposões Polimorfismos: verificados em mais de 1% da polulação, sendo transmissíveis à descendência. Geralmente sem ou com consequências fenótipicas não negativas. Mutações: geralmente associadas a patologias, daí não se “alastrararem” muito (menos de 1% da população). Variações genéticas

Alelo - cada uma das variantes possíveis de um locus polimórfico.

Locus – posição de um gene ou de um marcador genético num cromossoma.

Tipos de polimorfismos:

> SNPs

> VNTRs

> Polimorfismos de repetição de transposões

Polimorfismos: verificados em mais de 1% da polulação, sendo transmissíveis à descendência. Geralmente sem ou com consequências fenótipicas não negativas.

Mutações: geralmente associadas a patologias, daí não se “alastrararem” muito (menos de 1% da população).

Variações genéticas

Caso de Estudo – a Medicina Forense e a Violação Sexual Nos casos de violação e noutros cenários criminais, as recolhas de amostras biológicas (sangue, cabelo, sémen, etc…) permitem o isolamento do DNA de um eventual suspeito. Após a recolha e amplificação da amostra de DNA pela técnica de PCR bem como a sequenciação destes é possível ainda a descoberta de polimorfismos particulares e consequente identificação do criminoso.

Nos casos de violação e noutros cenários criminais, as recolhas de amostras biológicas (sangue, cabelo, sémen, etc…) permitem o isolamento do DNA de um eventual suspeito.

Após a recolha e amplificação da amostra de DNA pela técnica de PCR bem como a sequenciação destes é possível ainda a descoberta de polimorfismos particulares e consequente identificação do criminoso.

A Investigação de uma Violação A vítima de violação foi uma rapariga de 14 anos, portadora de Síndroma de Down, no Rio de Janeiro em 1998. O crime foi notificado apenas alguns meses mais tarde, quando a gravidez resultante da violação se tornou evidente. Assim, a análise forense do sémen do violador estava fora de questão. A vítima obteve autorização judicial para uma interrupção da gravidez. O feto abortado foi então analisado para identificar o pai biológico, tal como a mãe e 4 suspeitos deste caso de violação.

A vítima de violação foi uma rapariga de 14 anos, portadora de Síndroma de Down, no Rio de Janeiro em 1998.

O crime foi notificado apenas alguns meses mais tarde, quando a gravidez resultante da violação se tornou evidente.

Assim, a análise forense do sémen do violador estava fora de questão.

A vítima obteve autorização judicial para uma interrupção da gravidez.

O feto abortado foi então analisado para identificar o pai biológico, tal como a mãe e 4 suspeitos deste caso de violação.

Técnicas Utilizadas: Extracção do DNA Material biológico: Recolha de sangue da vítima e suspeitos Tecido da pele do feto Incubação (15-18 horas, 56ºC) Uso de fenol e clorofórmio para extracção de DNA Suspensão das preparações de DNA em solução ( 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA) Verificação da integridade do DNA: amostras colocadas num gel de agarose 0,8% com brometo de etídio  electroforese, 100V, 15 minutos  medição da densidade do DNA

Material biológico:

Recolha de sangue da vítima e suspeitos

Tecido da pele do feto

Incubação (15-18 horas, 56ºC)

Uso de fenol e clorofórmio para extracção de DNA

Suspensão das preparações de DNA em solução ( 10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA)

Verificação da integridade do DNA: amostras colocadas num gel de agarose 0,8% com brometo de etídio  electroforese, 100V, 15 minutos  medição da densidade do DNA

Técnicas Utilizadas: PCR Análise de 6 loci STRs DNA template + dNTP’s de STR + primers sintéticos (CTT ou FFv) + U Taq polimerase PCR: Desnaturação inicial, 2 min, 96ºC 10 ciclos de: 1 min a 94ºC, 1 min a 60ºC, 1,5 min a 70ºC 20 ciclos de 1 min a 90ºC, 1 min a 60ºC e 1,5 min a 70ºC Os produtos da amplificação por PCR foram analisados num gel de agarose, 2%.

Análise de 6 loci STRs

DNA template + dNTP’s de STR + primers sintéticos (CTT ou FFv) + U Taq polimerase

PCR:

Desnaturação inicial, 2 min, 96ºC

10 ciclos de: 1 min a 94ºC, 1 min a 60ºC, 1,5 min a 70ºC

20 ciclos de 1 min a 90ºC, 1 min a 60ºC e 1,5 min a 70ºC

Os produtos da amplificação por PCR foram analisados num gel de agarose, 2%.

Técnicas Utilizadas Análise dos Alelos STRs: Desnaturação a 95ºC, 2 min O material amplificado foi introduzido num gel de poliacrilamida (4%) com “corante de prata” e submetido a electroforese Análise de 3 loci VNTRs Digestão do DNA com enzimas de restrição: Amostras de DNA genómico foram digeridas com Hae III, a 37ºC Os fragmentos resultantes foram precipitados pela adição de acetato de amónio e etanol Incubação a -20ºC, 2 horas Centrifugação, velocidade máxima, 10 min Suspensão em solução tampão

Análise dos Alelos STRs:

Desnaturação a 95ºC, 2 min

O material amplificado foi introduzido num gel de poliacrilamida (4%) com “corante de prata” e submetido a electroforese

Análise de 3 loci VNTRs

Digestão do DNA com enzimas de restrição:

Amostras de DNA genómico foram digeridas com Hae III, a 37ºC

Os fragmentos resultantes foram precipitados pela

adição de acetato de amónio e etanol

Incubação a -20ºC, 2 horas

Centrifugação, velocidade máxima, 10 min

Suspensão em solução tampão

Técnicas Utilizadas Electroforese: Os fragmentos foram separados num gel de agarose, 0.8%, 24 horas, 20V Transferência e sequenciação por hibridação: Tratamento e transferência de gel para membrana de nylon Hibridação desta com sequências de DNA quimioluminescentes (sondas) Análise Estatística Recorrência a uma base de dados da população do Rio de Janeiro Southern blot

Electroforese:

Os fragmentos foram separados num gel de agarose, 0.8%, 24 horas, 20V

Transferência e sequenciação por hibridação:

Tratamento e transferência de gel para membrana de nylon

Hibridação desta com sequências de DNA quimioluminescentes (sondas)

Análise Estatística

Recorrência a uma base de dados da população do Rio de Janeiro

Resultados Os resultados da electroforese mostram que três dos suspeitos podem ser excluídos e apenas o suspeito nº3 é um potencial pai biológico do feto, depois da sequenciação dos vários loci (VNTR e STR). Os alelos sequenciados nos 6 loci STR em cada suspeito encontram-se esquematizados na tabela seguinte.

Os resultados da electroforese mostram que três dos suspeitos podem ser excluídos e apenas o suspeito nº3 é um potencial pai biológico do feto, depois da sequenciação dos vários loci (VNTR e STR).

Os alelos sequenciados nos 6 loci STR em cada suspeito encontram-se esquematizados na tabela seguinte.

 

Resultados Loci de STRs que se revelaram motivo de exclusão dos suspeitos: Suspeito nº1 – TPOX, F13A01 e vWA Suspeito nº2 – CSF1PO, TPOX, THO1, FESFPS, vWA Suspeito nº4 – TPOX, F13A01, FESFPS, vWA Loci de VNTRs que se revelarem mais um motivo de inclusão do suspeito nº3, em comparação com a vítima e o feto: D7S467, D8S358 e D10S28 Conclusão O Índice de Paternidade Combinado é de 412.860, pelo que a probabilidade de ser o pai biológico do feto abortado é de 99,9997%. Assim, conclui-se que o violador é o Suspeito nº3.

Loci de STRs que se revelaram motivo de exclusão dos suspeitos:

Suspeito nº1 – TPOX, F13A01 e vWA

Suspeito nº2 – CSF1PO, TPOX, THO1, FESFPS, vWA

Suspeito nº4 – TPOX, F13A01, FESFPS, vWA

Loci de VNTRs que se revelarem mais um motivo de inclusão do suspeito nº3, em comparação com a vítima e o feto:

D7S467, D8S358 e D10S28

O Índice de Paternidade Combinado é de 412.860, pelo que a probabilidade de ser o pai biológico do feto abortado é de 99,9997%.

Assim, conclui-se que o violador é o Suspeito nº3.

Referências Bibliográficas http://www2.ufp.pt/~jcabeda/pdf/sebenta-sequenciacao.pdf GOES, Andréa Carla de Souza, SILVA, Dayse Aparecida da, DOMINGUES, Cristiane Santana et al . Identification of a criminal by DNA typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil . Sao Paulo Med. J., May 2002, vol.120, no.3, p.77-79. ISSN 1516-3180 COOPER, Geoffrey M.; HAUSMAN, Robert E., “The Cell – A Molecular Approach”, ASM Press e Sinauer Associates, 4ª edição, 2007

http://www2.ufp.pt/~jcabeda/pdf/sebenta-sequenciacao.pdf

GOES, Andréa Carla de Souza, SILVA, Dayse Aparecida da, DOMINGUES, Cristiane Santana et al . Identification of a criminal by DNA typing in a rape case in Rio de Janeiro, Brazil . Sao Paulo Med. J., May 2002, vol.120, no.3, p.77-79. ISSN 1516-3180

COOPER, Geoffrey M.; HAUSMAN, Robert E., “The Cell – A Molecular Approach”, ASM Press e Sinauer Associates, 4ª edição, 2007

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