Tesis: SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES

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Published on March 7, 2014

Author: angieluzbp

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SYSTEM TO ESTIMATE THE QUANTIFICATION OF ‘GAMITANA’ POST LARVAE Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), USING DIGITAL IMAGE PROCESSING
by Angela Berrocal Pomalima

SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES SYSTEM TO ESTIMATE THE QUANTIFICATION OF ‘GAMITANA’ POST LARVAE Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), USING DIGITAL IMAGE PROCESSING TESIS para optar al título profesional de INGENIERO PESQUERO ACUICULTOR Presentado por la Bachiller ANGELA BERROCAL POMALIMA Asesor Dr. VÍCTOR RAÚL MORENO GARRO Universidad Nacional Federico Villarreal Asesor LIMA – PERÚ 2012 Dr. FERNANDO ALCÁNTARA BOCANEGRA Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE OCEANOGRAFÍA, PESQUERÍA, CIENCIAS ALIMENTARIAS Y ACUICULTURA ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA EN ACUICULTURA SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES SYSTEM TO ESTIMATE THE QUANTIFICATION OF ‘GAMITANA’ POST LARVAE Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), USING DIGITAL IMAGE PROCESSING TESIS para optar al título profesional de INGENIERO PESQUERO ACUICULTOR Presentado por la Bachiller ANGELA BERROCAL POMALIMA Asesor Dr. VÍCTOR RAÚL MORENO GARRO Universidad Nacional Federico Villarreal Asesor LIMA – PERÚ 2012 Dr. FERNANDO ALCÁNTARA BOCANEGRA Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana

Contenido PARTE 1 INTRODUCCIÓN 1 CAPÍTULO I. OBJETO DE LA INVESTIGACIÓN 2 1.1. Antecedentes 1.2. Planteamiento del problema 1.3. Objetivos 1.3.1. General 1.3.2. Específico 1.4. Justificación e importancia 1.5. Necesidades, alcances y limitaciones 1.6. Definición de variables 2 3 4 4 4 4 5 5 CAPÍTULO II. MARCO TEÓRICO 6 2.1. Procesamiento digital de imágenes (pdi) 2.2. Análisis digital de imágenes en muestras biológicas 2.3. ImageJ 2.4. Hipótesis 2.4.1. General 2.4.2. Específica 6 7 8 9 9 9 PARTE II CAPÍTULO III. MÉTODO 10 3.1. Descripción y ubicación del lugar 3.2. de investigación Tipo 3.3. Diseño de investigación 3.4. Estrategias de prueba de hipótesis 3.5. Unidad de análisis 3.6. Unidad experimental 3.7. Método experimental de muestreo 3.7.1 I Etapa 3.7.2 II Etapa 3.8. Variables de investigación 3.9. Población 3.10. Muestra 3.11. Técnicas de investigación 10 12 12 12 13 13 16 16 17 17 18 18 19

3.11.1 Instrumentos de recolección de datos: Descripción de mate riales, equipos y software 3.11.1.1 Materiales 3.11.1.2 Equipos 3.11.1.3 Software 19 19 20 20 3.11.2 Procedimiento 3. 11.2.1 Obtención de post larvas 3. 11.2.2 Adaptación de las post larvas 3. 11.2.3 Alimentación de las post larvas 3. 11.2.4 Procedimiento de recolección de datos 3. 11.2.5 Control de la calidad del agua del cultivo 21 22 22 22 23 23 Procesamiento y análisis de datos por pdi (procesamiento 3.11.3 digital de imágenes) 25 3. 11.3.1 Apertura de la imagen 25 3. 11.3.2 Cuantificación 26 3. 11.3.3 Medición en longitud 28 PARTE III CAPÍTULO IV. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS 33 4.1. Etapa I: Etapa Experimental 4.2. Etapa II: Etapa de Validación e implementación 33 34 CAPÍTULO V. DISCUSIÓN 36 los resultados 1. De 2. Conclusiones 3. Recomendaciones 36 38 38 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 39 ANEXOS 41

Lista de figuras Figura 1. Fórmula de Rothbard 4 Figura 2. Análisis morfométrico digital de una partícula (soma neuronal) 7 realizado con el software ImageJ Figura 3. Ventana de menú de ImageJ 8 Figura 4. Ubicación del lugar (CIQ – IIAP) 11 Figura 5. Vista frontal de los laboratorios (AQUAREC) 11 Figura 6. de Investigación 12 Tipo Figura 7. de investigación 12 Diseño Figura 8. Estrategias de prueba de hipótesis 12 Figura 9. Unidad experimental - Etapa I 13 Figura 10. experimental - Etapa II 14 Unidad Figura 11. experimental - Etapa I 15 Diseño Figura 12. Conteo: Método experimental de muestreo 16 Figura 13. Variables de investigación 17 Figura 14. Población y muestra de la investigación 18 Figura 15. Materiales. (a) Estanque rectangular (0,7 x 1,1 x 1) m; (b) post larvas de gamitana; (c) recipientes plásticos; (d) lata de quistes de Artemia AQUAMARINE de 1 libra; (e) regla milimetrada; (f) placa Petri de vidrio; (g) Pipetas Pasteur de plástico (3 ml) Figura 16. 19 Equipos. (a) Potenciómetro WTW integrado con termómetro; (b) oxímetro YSI 55 DISSOLVED OXYGEN; (c) cámara fotográfica digital Panasonic DMC-ZS10; (d) Computadora portátil HP Pavilion dv4-1425la 20 Figura 17. Resumen del procedimiento experimental - Etapa I 21 Figura 18. Nauplios de Artemia sp. 22 Figura 19. Muestreo de mortalidad 23

Figura 20. Procedimiento de recolección de datos: Etapa I 24 Figura 21. Recolección de datos – Etapa II: Toma de muestras 24 Figura 22. Procedimiento de apertura de una imagen utilizando comandos 25 Figura 23. Procedimiento de apertura de una imagen sin utilizar comandos 26 Figura 24. Cuantificación por procesamiento digital de imágenes: (a) Selección de herramienta multipoint; (b) Herramienta multipoint seleccionada; (c) Conteo de los ejemplares por puntos enumerados de selección; (d) Resultado inmediato del conteo; (e) Tabla de resultados (Tecla ‘Ctrl’ + M); (f) y (g) otras opciones útiles: puntos de selección. borrar y mover Figura 25. 27 Cambio de color de la herramienta multipoint: Hacer doble clic en la herramienta point y elegir cualquiera de los colores disponibles 28 Figura 26. Calibración de la imagen con la herramienta Set Scale: (a) Selec ción del patrón de medida conocido; (b) Apertura de la herramienta; (c) Inicio de la ventana Set Scale; (d) Llenado de datos de distancia conocida y unidad de medida de la misma. Figura 27. 29 Procedimiento de medición de los ejemplares utilizando la herramienta Set Scale: (a) Selección de la herramienta Straight, (b) Selección del individuo; (c) Resultado con dos decimales; (d) Tabla de Resultados (‘Ctrl’+ M) 30 Figura 28. Protocolo – Diagrama de operaciones 35 Figura 29. Mortalidad (%) y crecimiento en longitud media (cm) de las post 37 larvas en los métodos evaluados

Lista de tablas Matriz de consistencia 31 Tabla 1. Tabla de calificación de grado de estrés para conteo manual 32 Tabla 2. Tabla de calificación de daños mecánicos para conteo manual 32 Tabla 3. Resultados de mortalidad (%) de los métodos manual (tradicional) 33 y digital (propuesto) Tabla 4. Resultados de crecimiento en longitud total (cm) de los métodos manual (tradicional) y digital (propuesto) 34 Tabla 5 34 Estadísticos descriptivos Tabla 6. Contraste de resultados de crecimiento en longitud total (cm) y mortalidad (%) de los métodos manual (tradicional) y digital (propuesto) 37 Lista de anexos Anexo 1. Ubicación del lugar (CIQ – IIAP) 41 Anexo 2. Reproducción inducida de progenitores criados en cautiverio (CIQ – IIAP) 42 Anexo 3. Calidad del agua del cultivo de los métodos evaluados 42 Anexo 4. Generalidades de ImageJ 43 Anexo 5. Registro de longitud total inicial de las post larvas 44 Anexo 6. Registro de crecimiento en longitud total final de las post larvas 46 Anexo 7. Estadísticos descriptivos finales de ambos métodos 47

A Dios, a mis padres: Sra. Fanny Pomalima y Sr. César A. Berrocal, a mis hermanos: Fanny Patricia, Ana Cecilia y Ángel Jesús, a mis amigos y maestros, a los cuales agradezco su apoyo incondicional. A mi amigo y compañero Guillermo Eder Felipa, quien ha sido un constante y gran soporte durante este capítulo académico.

Agradecimientos A las autoridades y a todo el personal científico, técnico y administrativo del Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana (IIAP), por medio del Programa de Investigación para el Uso y Conservación del Agua y sus Recursos (AQUAREC), por el financiamiento y facilidades brindadas para la ejecución de este estudio. Al Ing. Salvador Tello, al Dr. Fred Chu y al Blgo. Luciano Rodríguez por darme la oportunidad de ejecutar este proyecto. Al Ing. Agustín Gonzales, por haberme facilitado el ingreso al IIAP como practicante. Dres. Fernando Alcántara y Víctor Raúl Moreno, por su constante asesoramiento y compromiso con la investigación. A la Blga. Violeta Valdivieso, por su constante asesoramiento, paciencia y apoyo a lo largo de toda la investigación. Al Ing. Walter Blas, por sus consejos, orientaciones, recomendaciones y constante apoyo. Al Ing. Daniel Oré, por sus recomendaciones, sugerencias y observaciones brindadas. A la Ing. Luz Taype, por haberme enseñado la química de la vida. Al Ing. Valentín Mogollón, por su gran sentido del humor y confianza de padre. Al Ing. Manuel Figueroa e Ing. Carlos Llontop, por sus consejos y recomendaciones. A la Ing. Catalina Díaz, por haberme formado en la línea de la investigación. Al Ing. César Luck, Ing. Gabriela Molina, Blga. Betty Gamero, Dra. Susana Sirvas, Dr. Juan Acosta, Lic. Marcela Uría, Ing. Miriam Niebuhr, Ing. Claudio Álvarez, Ing. Carmen San Román, Ing. Gustavo Saavedra, Ing. Walter Smith, Ing. César Peña, Ing. Guillermo Tello, Ing. Gustavo Laos, Dr. Pedro Rodenas, Ing. Gregorio Gallo, por haberme brindado sus conocimientos de manera desinteresada en mi formación profesional. Al personal técnico y administrativo que labora en el Programa de Investigación para el Uso y Conservación del Agua y sus Recursos: Lamberto Arévalo, Vilto Huayunga, Italo Orbe, Edwin Agurto, Cherry Yahuarcani, Asunción Apuela, Hugo Marichin, Medardo Montoya, Domingo García, Luis Zafra, Edgar Taricuarima, al Sr. Miguel Ríos y a la Sra. Mercedes Torres por las facilidades brindadas durante la ejecución de la tesis. A los tesistas (CIQ- IIAP) 2012, Ely Maynas, Italo Bardales, Margarita Colichón y Edgar Meza; mis amigos practicantes IIAP 2012, de Iquitos: Christian Manchinari, Paul Franco, Joao Oliveira, Omar Delgado; Tingo María: Wilson Rodríguez, Raul Pullido, Enrique Cornejo, Miguelina Vicuña; Pucallpa: Lewis Valerio, Caleb Angulo; Chiclayo: Iván Collin Guevara, Martin Correa y Lima: Fransisk Sánchez, por su amistad, apoyo y momentos gratos. A mis compañeros de estudio, en especial a Rosa Gaona, Diana Allain, Carlos Julca, Paul Haro, Wilmer Gaspar, Jorge Espinoza, Luis Calderón y Peter Alcocer, por ser incondicionales. A mi amigo Erik Sánchez, por su preocupación, constante apoyo y toque de humor durante este proceso. A todas aquellas personas que de alguna forma contribuyeron a la realización de la presente investigación.

SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA”, Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES Resumen La implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de “gamitana” Colossoma macropomum, empleando el procesamiento digital de imágenes, que busca facilitar el conteo, reducir la manipulación de los individuos, disminuir el estrés, el índice de mortalidad y las posibles pérdidas económicas derivadas de las mismas; se realizó en dos etapas: La primera de experimentación y la segunda de validación e implementación. Donde se determinó el impacto del estrés por manipulación de la metodología manual frente a la metodología digital en las post larvas, evaluando las variables de crecimiento y mortalidad, en la primera etapa (etapa I); y el error de estimación en la cuantificación, en la segunda etapa (etapa II). La etapa I, cuyo inicio fue el día 26 de enero del 2012, contó con un estudio preliminar, que tuvo como finalidad evaluar el comportamiento de las variables consideradas para el análisis estadístico, así como la incidencia de los parámetros físico-químicos (pH, temperatura y oxígeno disuelto) sobre las mismas y un posible ajuste u optimización en la metodología propuesta. Asimismo, consistió en muestreos diarios de mortalidad y semanales de crecimiento, desde el día 12 hasta el día 47 de edad. En el muestreo diario, se registró y retiró la cantidad de individuos muertos de cada unidad experimental, mientras que en el muestreo semanal, se contó al 50 % de los individuos de forma manual (método tradicional), utilizando pipetas y al otro 50 % de forma digital (método propuesto), utilizando, para ello, una regla metálica milimetrada de 100 mm, como patrón de medida, necesario para realizar la morfometría computarizada, una cámara fotográfica digital Panasonic DMC-ZS10 como herramienta de captura de imágenes digitales y el software ImageJ 1.46, para el procesamiento digital de imágenes; y midiendo al 100 % de los ejemplares por procesamiento digital. De esta manera se realizaron seis muestreos en la etapa experimental (a los 12, 19, 26, 33, 40, 47 días de edad) y los resultados de ambos métodos (manual y digital) fueron analizados estadísticamente utilizando la prueba “t”. Durante la etapa de validación, se tomaron diez muestras de 200 ml de cada uno de los cuatro grupos de 5000 post larvas cada uno (a una densidad de 1000 post larvas.L-1) a ser evaluados, se colocaron en recipientes transparentes de plástico y junto con una regla metálica milimetrada de 100 mm, como patrón de medida, se fotografiaron, para ser procesadas por el software ImageJ 1.46 y, mediante la fórmula de Rothbard, determinar el coeficiente de variación (CV) de la estimación en contraste con la cuantificación real. Los resultados en ambas etapas señalaron al método propuesto como mejor alternativa para cuantificación de post larvas de gamitana. Con un CV menor al 5 %, así como mortalidad del (4,60 + 1,69) % y crecimiento en longitud de (0,7396 + 0,0453) cm al emplear el procesamiento digital de imágenes; frente al (25,50 + 0,35) % y (0,6696 + 0,0265) cm al ser realizado manualmente. Palabras claves: Cuantificación, post larva, procesamiento digital de imágenes.

SYSTEM TO ESTIMATE THE QUANTIFICATION OF ‘GAMITANA’ POST LARVAE Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), USING DIGITAL IMAGE PROCESSING Abstract The implementation of a system to estimate the quantification of ‘gamitana’ post larvae Colossoma macropomum, using digital image processing, which aims to facilitate the counting, to reduce handling of individuals, stress, the mortality rate and the economic possible losses derived therefrom, was made in two stages: The first of experimentation and the second of validation and implementation. Where it was determined the impact of stress by post larvae manipulation of the methodology manual versus digital methodology, evaluating variables of growth and mortality, in the first stage (stage I), and the estimation error on the quantification, in the second stage (stage II). Stage I, whose start was on January 26, 2012, count with a preliminary study, which aimed to evaluate the behavior of the variables considered for statistical analysis, and the impact of physical-chemical parameters (pH, temperature and dissolved oxygen) on them and a possible adjustment or optimization in the proposed methodology. In addition, it consisted in daily samplings of mortality and weekly of growth, from day 12 to day 47 of age. In the daily sampling was recorded and withdrew the amount of dead individuals of each experimental unit, while in the weekly sampling was counted 50 % of the individuals manually (traditional method) using pipettes and the other 50 % by digital form (proposed method), using, for this purpose, a steel ruler of 100 mm, as a standard of measurement, necessary for computerized morphometry, a digital camera Panasonic DMC-ZS10 as a tool for digital image capture and software ImageJ 1.46, for digital images processing; and measuring of 100 % of the specimens by digital processing. Thus six samplings were performed in the pilot phase (at 12, 19, 26, 33, 40, 47 days old) and the results of both methods (manual and digital) were analyzed statistically using test-T. During the validation stage, ten samples of 200 ml each were taken from each of the four groups of 5000 post larvae (at a density of 1000 post larvae.L-1), to be evaluated were placed in transparent plastic containers with a 100 mm steel ruler, as a standard of measurement, it was photographed to be processed by the software ImageJ 1.46 and by Rothbard formula, it was determined the coefficient of variation (CV) of the estimation in contrast with the real quantification. The results in both stages indicated the proposed method as a better alternative for quantification of gamitana post larvae. With a CV < 5 %, mortality rate of (4,60 + 1,69) % and increase in length of (0,7396 + 0,0453) cm by using digital image processing; versus (25,50 + 0,35) % and (0,6696 + 0,0265) cm at being done manually. Keywords: Quantification, post larvae, digital image processing.

ESTRUCTURA DE LA TESIS Parte I Objeto de la investigación Marco teórico Capítulo I Introducción Capítulo II Parte II Método Capítulo III Parte III Presentación de resultados Discusión Capítulo IV Capítulo V 1. De los resultados 2. Conclusiones 3. Recomendaciones En la PARTE I: Se desarrolla la introducción al tema de tesis y se presentan los capítulos I y II: En el Capítulo I, que se refiere al objeto de la investigación, se plantea el problema y sus variables, se expresan los objetivos, se justifica la importancia de la presente investigación en la acuicultura, así como los alcances y las limitaciones de la tesis. En el Capítulo II, se refiere al marco teórico, donde se citan y explican las bases teóricas que respaldan el uso de las mismas en la presente investigación. En la PARTE II: El Capítulo III, describe el desarrollo de la investigación, así como la metodología utilizada, el uso de software y el procesamiento de los datos de campo. En la PARTE III: El Capítulo IV, presenta los resultados obtenidos en el campo y en el gabinete. Por último, en el capítulo V, a través de las discusión se hace un análisis de los resultados obtenidos. Asimismo, se indican las conclusiones del estudio y las recomendaciones del autor. No se discute exhaustivamente con otros autores porque no se han encontrado antecedentes similares. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES

Introducción “El objetivo económico de las naciones, como el de los individuos, es lograr el máximo rendimiento con el mínimo esfuerzo. Todo el progreso económico de la humanidad ha consistido en obtener mayor producción con el mismo trabajo”. Henry Hazlitt (2006) Economics in One Lesson Fox &Wilkes L a acuicultura amazónica presenta la necesidad de contar con procesos que mejoren su eficiencia y productividad. Actualmente existen muchos factores por los cuales la mejora del proceso de conteo de post larvas de “gamitana” Colossoma macropomum debe ser llevada a cabo de una manera diferente a la tradicional. Considerando que ésta es una especie de alto consumo en la Amazonía, la reducción de horas–hombre, individuos de mejor calidad, con menor mortalidad, manipulación y estrés, se hace necesario. El presente trabajo de investigación trata sobre la implementación un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de “gamitana” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) empleando el procesamiento digital de imágenes, cuyo propósito es disminuir las horas-hombre empleadas para realizar el proceso de conteo de las post larvas. Así como, reducir el grado de estrés y daños mecánicos de los individuos, ocurrido por manipulación en el proceso, con el cual se espera satisfacer las necesidades en esta etapa de producción, tanto del productor como del comprador y de los cuales se obtenga el máximo valor beneficio de la inversión al implementar este sistema. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  1

I. OBJETO DE LA INVESTIGACIÓN “Investigar es ver lo que todo el mundo ya ha visto y pensar lo que nadie ha pensado todavía”. Albert Szent-Györgyi (2003) Worth repeating: more than 5000 classic and contemporary quotes Kregel Academic 1.1. Antecedentes La acuicultura engloba todas las actividades que tienen por objeto la producción, crecimiento y comercialización de organismos acuáticos, animales o vegetales, de aguas dulces, saladas o salobres (Calixto et al., 2006). Como actividad multidisciplinaria constituye una empresa productiva que utiliza los conocimientos sobre biología, ingeniería y ecología; y según la clase de organismos que se cultivan se ha dividido en varios tipos, siendo uno de los más desarrollados la piscicultura, o cultivo de peces (Cifuentes et al., 1999), la cual requiere de controles e inventarios periódicos (Castelló, 1993). Dentro de los controles, el control del crecimiento y el inventario del conteo depende principalmente de la evolución del tamaño (o masa) del pez Brett et al. (1969; citado por MacDaid & Nath, 1997) y podría ocasionar un ligero estrés en los individuos, dependiendo de la manipulación (Buxadé, 1997). SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  2

Evitar el estrés en peces es fundamental para su supervivencia y desarrollo, sobre todo para el cultivo. No obstante, la estabilidad de los peces se encuentra continuamente amenazada por perturbaciones intrínsecas y por variaciones externas Lacoste (2001; citado por Weber, 2009). La manipulación, que es un factor externo, genera a menudo inhibición momentánea del consumo de alimento debido al estrés (Guillaume et al., 2003) En los últimos años, el procesamiento de imágenes se ha convertido en una herramienta muy útil para la automatización de procesos, monitoreo y control de especies, reduciendo así la manipulación de las mismas (López, 2010). Además reduce el tiempo de análisis y el error (Chirinos et al., 2004), brinda resultados más precisos (Caldas & Hurtado, 2007) y más significativos al analizar el total de individuos observados en una muestra (Chirinos et al., 2004). 1.2. Planteamiento del problema La acuicultura en la Amazonía peruana ha crecido de forma extraordinaria en los últimos años, debido fundamentalmente a los avances obtenidos en la producción de alevines de especies nativas, como paco Piaractus brachypomus y gamitana Colossoma macropomum, en condiciones controladas Reyes (1998; citado por Deza et al., 2002). En el Perú, la producción de estos alevines es una práctica dominada por instituciones especializadas en acuicultura amazónica. El Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana (IIAP) y otras instituciones del Estado como FONDEPES, han venido trabajando en la producción de larvas, post larvas, alevines y desarrollan programas de cultivo intensivo para repoblamiento y comercialización (Hurtado, 2010). A pesar que ya se domina este procedimiento, aún existen algunas falencias en la etapa de pre producción de alevines, específicamente en el control y distribución de dichos individuos, puesto que hasta la fecha la cuantificación de los mismos se realiza de forma individual y manual, lo cual presenta problemas, que se mencionan a continuación: Estrés, daños mecánicos y contaminación de las post larvas, por ser objeto de manipulación. Elevada inversión horas-hombre para realizar el conteo, así como excesivo tiempo de espera por parte de los compradores. Genera error de conteo en perjuicio del productor, lo cual causa inevitables pérdidas económicas. Es por ello que se formuló la implementación de un sistema, con el propósito de estimar la cuantificación de post larvas de gamitana Colossoma macropomum a través del procesamiento digital de imágenes (pdi) y el uso de la fórmula de Rothbard (Figura 1). Con la intención de disminuir las horas-hombre empleadas para realizar el conteo de las post larvas. Así como, reducir el grado de estrés y daños mecánicos de los individuos, ocurrido por manipulación en el conteo, evaluando variables de crecimiento en longitud y mortalidad. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  3

Fórmula de Rothbard. Fórmula de estimación larval de peces por volumetría. VN Ʃni N= KV ni Figura 1. Fórmula de Rothbard donde: N = Número total de post larvas ni = Número de post larvas en la muestra V = Volumen del recipiente de post larvas K = Número de muestras (K > 1) Rothbard (1982; citado por Alcántara & Guerra, 1988) 1.3. Objetivos 1.3.1. General Estimar la cuantificación de post larvas de gamitana Colossoma macropomum empleando el procesamiento de imágenes digitales. 1.3.2. Específicos Determinar el grado de estrés de las post larvas por manipulación en el conteo. Determinar el grado de daños mecánicos de las post larvas ocurrido por manipulación en el conteo. Disminuir las horas-hombre empleado para el conteo de las post larvas. 1.4. Justificación e importancia El sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana empleando el procesamiento digital de imágenes, busca reducir el estrés, daños mecánicos y contaminación de las post larvas de gamitana, por manipulación y con ello la obtención de incrementar la tasa de supervivencia en esta etapa. Del mismo modo, busca disminuir el error de conteo y así, realizar una estimación más precisa de los individuos. La investigación resulta importante, porque la metodología empleada se utiliza por primera vez en la acuicultura de la C. macropomum, especie amazónica nativa. Asimismo, utiliza tecnología y no requiere de mucho esfuerzo ni de elevada inversión horas-hombre, dando como punto a favor la disminución en el costo de producción. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  4

1.5. Necesidades, alcances y limitaciones La acuicultura amazónica presenta la necesidad de contar con procesos que mejoren su eficiencia y productividad. En materia de venta y repoblamiento de ejemplares de gamitana en estado post larval, se observa el requerimiento de mejora para el proceso de conteo, pues resulta tedioso para el productor, debido al tiempo empleado. Asimismo, se tiende a estresar a los individuos e incluso presentar mortalidad por el método acostumbrado. Los resultados y conclusiones de esta investigación tienen validez y pueden generalizarse a la población estudiada, conformada por post larvas de gamitana Colossoma macropomum, cuya distribución se extiende en la Amazonía. La presente investigación, que sólo comprende post larvas de gamitana Colossoma macropomum y analiza variables de crecimiento en longitud (cm) y mortalidad (%), destaca las siguientes limitaciones: Escasez de antecedentes de la investigación (libros, revistas especializadas, tesis, Internet) relacionados con métodos de cuantificación de post larvas de especies amazónicas o el uso del procesamiento digital en acuicultura. Escasez de material bibliográfico y científico sobre el tema, específicamente sobre procesamiento digital de imágenes para el conteo en post larvas de peces, por tratarse de un tema nuevo y de reciente incorporación en el ámbito acuícola. Inexistencia de procedimientos estandarizados y validados para contar post larvas de peces amazónicos. 1.6. Definición de variables 1.6.1 Independiente “X” Grado de estrés producido en el conteo Grado de daños mecánicos ocurridos en el conteo 16.2 Dependiente “Y” Índice de mortalidad Crecimiento en longitud SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  5

II. MARCO TEÓRICO “El procesado de la imagen digital y su respectivo análisis es necesario en la imagen científica y tiene como objetivo mejorar y procesar automáticamente la información implícita en la imagen para la interpretación humana” Bueno & Dorado (2007) Gestión, procesado y análisis de imágenes biomédicas Ediciones de la Universidad de Castilla – La Mancha 2.1. Procesamiento digital de imágenes (pdi) El procesamiento digital de imágenes puede definirse como una forma de extraer información cuantitativa a partir de imágenes Wootton (1995; citado por Caldas & Hurtado, 2007); y que consiste en descubrir, identificar, además de comprender los patrones que son relevantes en el rendimiento de un trabajo basado en imágenes (González & Woods, 1996). 1. Conceptos básicos: Abrams, 1997 / Wootton et al., 1995 / Ying & Cheung, (1999; citados por Caldas & Hurtado, 2007) Todo sistema de procesamiento y análisis de imágenes, como mínimo, debe ser capaz de ejecutar los siguientes pasos: a) Captura de la imagen en un formato digital que el computador pueda entender. b) Almacenamiento de la imagen. c) Utilización de programas con la capacidad suficiente para procesar las imágenes. Este procesamiento implica esencialmente, la mejora y segmentación de la imagen y su posterior análisis (extracción de la información cuantitativa). SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  6

a) La captura de la imagen, necesita un dispositivo de captación, que habitualmente es una cámara, que envía la señal a una tarjeta digitalizadora y, luego se pasa, al ordenador (Pertusa, 2003). b) El almacenamiento de la imagen, puede realizarse en archivos con múltiples formatos. La diferencia entre ellos está en la cantidad de información que guardan sobre la imagen. Los formatos TIFF (*.TIF) y BITMAP (*.BMP) son compatibles con prácticamente cualquier software de análisis de imágenes. Contienen información completa y precisa sobre la imagen digital. Los formatos JPEG (*.JGP) y GIF (*.GIF) son útiles para intercambiar imágenes a través de internet ya que reducen el tamaño del archivo (López, 2010). c) La utilización de programas con la capacidad suficiente para procesar las imágenes, por ejemplo ImageJ (para Windows o Linux; http://rsb.info.nih.gov/ij/) o su equivalente NIH-Image (para Macintosh; rsb.info.nih.gov/nih-image/Default. html) permiten realizar prácticamente cualquier tipo de análisis morfométrico y densitométrico de las imágenes capturadas (López, 2010). 2.2. Análisis digital de imágenes en muestras biológicas Se refiere al proceso de conteo y medición de los objetos que se encuentran en la imagen, después de haber sido procesada. Existen varios tipos de mediciones que pueden efectuarse sobre una imagen, entre los cuales, los más utilizados son la intensidad, la cantidad y el tamaño Murphy (2001; citado por Caldas & Hurtado 2007); el área, perímetro o incluso la longitud de los ejes de la elipse, que mejor describe la forma de la muestra, son también estimaciones involucradas en el análisis de imágenes, conocidas como morfometría óptica digital (Figura 2) (López, 2010). López-Poveda (2010) Análisis de Imágenes Universidad de Salamanca Figura 2. Análisis morfométrico digital de una partícula (soma neuronal) realizado con el software ImageJ. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  7

En muchas áreas profesionales, las muestras biológicas requieren un análisis visual sistemático y repetitivo. Este tipo de tareas, en muchos casos, puede ser automatizado, a través del análisis de imágenes, utilizando técnicas de visión por computadora, lo que presenta ciertas ventajas sobre el análisis visual realizado por un técnico, como: Reducción drástica del tiempo de análisis y del error, ya que al ser una máquina con la que se efectúa el conteo, se puede realizar un análisis más significativo de la muestra original (Chirinos et al., 2004) 2.3. ImageJ Es un programa de procesamiento y análisis de imagen digital de dominio público programado en Java desarrollado en el National Institutes of Health e inspirado por NIH Image para Macintosh. Puede mostrar editar, analizar, procesar, guardar, e imprimir imágenes de 8 bits (256 colores), 16 bits (miles de colores) y 32 bits (millones de colores). Puede leer varios formatos de imagen incluyendo TIFF, GIF, JPEG, BMP , DICOM, FITS, así como formatos RAW (Ferreira & Rasband, 2011). Cuenta con una ventana de menú, que aparece como una banda horizontal sobre el tapiz del escritorio que no se puede maximizar (Figura 3). Contiene una fila de comandos en la parte superior y una sencilla barra de herramientas abajo, con utilidades para la selección de regiones, trazado de líneas, zoom, entre otras. (Pertusa, 2003) Fila de comandos Barra de herramientas Figura 3. Ventana de menú de ImageJ Soporta pilas o lotes, una serie de imágenes que comparten una sola ventana, y es multiproceso, de forma que las operaciones que requieren mucho tiempo se pueden realizar en paralelo. Asimismo, pone a disposición la calibración espacial, que proporciona las dimensiones en unidades del mundo real tales como milímetros. El programa es compatible con cualquier número de imágenes al mismo tiempo, limitado solamente por la memoria disponible (Ferreira & Rasband, 2011). SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  8

ImageJ tiene más de una buena razón para ser utilizado: Es más sencillo que otros programas, además de ser un programa gratuito de procesado de imágenes científicas de lo más potente que se conoce, que está a disposición de todo el mundo y que entre todos se puede ir aprendiendo a utilizar (Campa, 2009 - 2010). 2.4. Hipótesis 2.4.1 General La implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana empleando el procesamiento digital de imágenes disminuye el error de estimación. 2.4.2 Específica La implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana disminuye: El grado de estrés producido en el conteo. El grado de daños mecánicos ocurrido en el conteo. Las horas-hombre empleadas en el conteo. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  9

III. MÉTODO “El progreso y el desarrollo son imposibles si uno sigue haciendo las cosas tal como siempre las ha hecho”. Wayne W. Dyer (2007) The sky is the limit Grijalbo 3.1. Descripción y ubicación del lugar El trabajo de investigación se realizó en las instalaciones del Centro de Investigaciones Quistococha del Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana (CIQ – IIAP), sede Iquitos, ubicado en el km 4,5 de la Carretera Iquitos – Nauta, Quistococha, distrito de San Juan Bautista, provincia de Maynas, región Loreto. A 03° 45’ 0586 latitud sur, 73° 14’ 4097 longitud oeste y a una altitud de 122,4 msnm (Figura 4 y Anexo 1). SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  10

LS. 03º 45’ 0586 LO. 73º 15’ 4097 Coordenadas geográficas Figura 4. Ubicación del lugar (CIQ – IIAP) El desarrollo experimental, fue realizado bajo el Marco del Programa de Investigación para el Uso y Conservación del Agua y sus Recursos (AQUAREC). Figura 5. Vista frontal de los laboratorios (AQUAREC) SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  11

3.2. Tipo de investigación Cualitativa y cuantitativa (Figura 6). Tipo de investigación Cuantitativa Cualitativa Variable X Variable Y Grado de daños mecánicos Grado de estrés Índice de mortalidad Crecimiento en longitud Porcentaje (%) Centímetros (cm) Puntaje de calidad (tabla de calificación) Figura 6. Tipo de Investigación 3.3. Diseño de investigación Experimental y de validación (Figura 7). Diseño de investigación Experimental Validación Variable Y Índice de mortalidad Variación de estimación Crecimiento de longitud Coeficiente de variación (CV) Figura 7. Diseño de investigación 3.4. Estrategias de prueba de hipótesis Prueba “t” de Student y coeficiente de variación (CV) (Figura 8). Estrategias de prueba de hipótesis Prueba “t” - Student Experimental Coeficiente de variación (CV) Validación Figura 8. Estrategias de prueba de hipótesis SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  12

3.5. Unidad de análisis El estrés por manipulación en “gamitanas”, Colossoma macropomum, en etapa post larval, como probable agente causal del incremento de la tasa de mortalidad y bajo crecimiento. 3.6. Unidad experimental El estudio se realizó en dos etapas: La primera de experimentación (Etapa I) y la segunda de validación e implementación (Etapa II). En la primera etapa, cada unidad experimental comprendió un grupo de 50 post larvas de gamitana, distribuidas en recipientes de plástico, con densidades iniciales de 60 000 post larvas.m-3 (densidad de producción) (Figura 9). Colossoma macropomum Figura 9. Unidad experimental - Etapa I SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  13

Cada unidad, fue suspendida en el agua, dentro de un estanque de concreto revestido con mayólica, con un flotador de tecnopor (poliestireno expandido). Todo el diseño experimental, mantuvo flujo de agua constante (1,2 L.min-1, en promedio) y fue protegido del medio externo con una tapa hecha de listones de madera y malla (Ver diseño experimental, Figura 11). En la segunda etapa, cada unidad experimental comprendió un grupo de 5 000 post larvas, distribuidas en contenedores plásticos (baldes), a una densidad de 1 000 post larvas.L-1 (Figura 10). Vista Frontal Vista interna Figura 10. Unidad experimental - Etapa II SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  14

SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  15 Unidad experimental Flujo de agua Figura 11. Diseño Experimental – Etapa I Estanques – Laboratorio I (AQUAREC) DISEÑO EXPERIMENTAL Recipiente plástico Estanque de concreto utilizado (Estanque N° 5) UNIDAD EXPERIMENTAL Colossoma macropomum post larva

3.7. Método experimental de muestreo 3.7.1 Etapa I: Para el estudio experimental se utilizaron 20 unidades experimentales con densidades iniciales de 60 000 post larvas.m-3 (densidad de producción). La estrategia de muestreo fue la siguiente: Control de mortalidad: Frecuencia: Diaria Consistió en registrar y retirar la cantidad de individuos muertos de cada unidad experimental. Conteo manual: Frecuencia: Semanal Realizado al 50 % de unidades experimentales, utilizando pipetas y placas Petri. Conteo digital: Frecuencia: Semanal Realizado al otro 50 % de unidades experimentales (Figura 12), utilizando una cámara fotográfica digital Panasonic DMC-ZS10 y el software ImageJ. Registro de crecimiento en longitud: Frecuencia: Semanal Realizado, utilizando un patrón de medida (regla milimetrada), con una cámara fotográfica digital Panasonic DMC-ZS10 y el software ImageJ. Figura 12. Conteo: Método experimental de muestreo SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  16

3.7.2 Etapa II: Para el estudio de validación y experimentación, se utilizaron 4 unidades experimentales con 5000 post larvas cada una, a una densidad de 1000 post larvas.L-1. La estrategia de muestreo fue la siguiente: Conteo manual De 5000 post larvas por unidad experimental. Realizado previo al conteo digital. Conteo digital Realizado para validar el método, determinar la desviación estándar de la estimación en contraste con la cuantificación real, utilizando la fórmula de Rothbard (Figura 1). 3.8. Variables de investigación Variable Y, representados en el índice de mortalidad (%) y crecimiento en longitud de las post larvas (cm); y variación de estimación, a través del coeficiente de variación del método implementado (Figura 13). Variables de investigación Variable Y Índice de mortalidad Variación de estimación Crecimiento de longitud Coeficiente de variación Figura 13. Variables de investigación SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  17

3.9. Población Variable Y: 60 000 post larvas de gamitana Colossoma macropomum. Variación de estimación: 20 000 post larvas de gamitana Colossoma macropomum 3.10. Muestra Variable Y: 1 000 post larvas de gamitana Colossoma macropomum. Variación de estimación: 5 000 post larvas de gamitana Colossoma macropomum. Población y muestra de investigación Variable Y Variación de estimación 60 000 post larvas* Población 20 000 post larvas 1 000 post larvas Muestra 5 000 post larvas Figura 14. Población y muestra de la investigación (*) Basado en densidad de producción (60 000 post larvas/ m3) SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  18

3.11. Técnicas de investigación 3.11.1 nstrumentos de recolección de datos: Descripción de materiales, I equipos y software 3.11.1.1. Materiales Veintidós millares de post larvas de gamitana de 5 días de edad, un millar para la etapa preliminar de experimentación, un millar para la experimentación y veinte millares para la validación. Un estanque rectangular de concreto, revestido con mayólica, de medidas (0,7 x 1,1 x 0,8) m de largo, ancho y tirante, como parte del diseño experimental. Pipetas Pasteur de plástico (3 ml), placas Petri de vidrio y cucharas de plástico, como herramientas de apoyo para el conteo manual de las post larvas. Veinte envases plásticos de un litro de capacidad, como contenedores de los individuos recipientes de apoyo para realizar los ensayos (etapa 1). Un vaso de precipitados de vidrio (250 ml), como material de apoyo para la obtención de muestras en la etapa de validación. Una plancha de tecnopor de 3 cm de espesor, de medidas (0,7 x 1) m de largo y ancho, como soporte de las unidades experimentales. Una libra de quistes de Artemia AQUAMARINE en lata, como alimento durante el tiempo que duró la experimentación. Se le suministró 1 ml de nauplios a una densidad promedio de 200 nauplios.ml-1 Regla metálica milimetrada de 100 mm, como patrón de medida, necesario para realizar la morfometría computarizada. Cuatro contenedores plásticos (baldes) de 10 litros de capacidad, como recipiente de apoyo para colocar las post larvas durante la etapa de validación. a b c d f e g Figura 15. Materiales. (a) Estanque rectangular (0,7 x 1,1 x 1) m; (b) post larvas de gamitana; (c) recipientes plásticos; (d) lata de quistes de Artemia AQUAMARINE de 1 libra; (e) regla milimetrada; (f) placa Petri de vidrio; (g) Pipetas Pasteur de plástico (3 ml) SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  19

3.11.1.2. Equipos: Potenciómetro WTW (pH: Sensibilidad: + 0,004; rango: 0,000 a 14,000; temperatura: Sensibilidad: + 0,2 °C; rango: 0,0 °C – 60,0 °C), para el monitoreo del pH y temperatura de las unidades experimentales. Oxímetro YSI 55 DISSOLVED OXYGEN (Sensibilidad: + 0,1 mg/l; rango: 0 a 10 mg/l), para el monitoreo del oxígeno disuelto de las unidades experimentales. Cámara fotográfica digital Panasonic DMC-ZS10, como herramienta de captura de imágenes digitales. Computadora portátil HP Pavilion dv4-1425la, como soporte para el procesamiento y análisis de imágenes. a b c d Figura 16. Equipos. (a) Potenciómetro WTW integrado con termómetro; (b) oxímetro YSI 55 DISSOLVED OXYGEN; (c) cámara fotográfica digital Panasonic DMC-ZS10; (d) Computadora portátil HP Pavilion dv4-1425la 3.11.1.3. Software: Software ImageJ 1.46, software utilizado para la medición digital de la longitud y cuantificación de las post larvas. Software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 18, paquete estadístico. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  20

3.11.2 rocedimiento P El estudio se realizó en dos etapas: La primera de experimentación y la segunda de validación e implementación (Figura 20 y 21): Etapa I: Cuyo inicio fue el día 26 de enero del 2012, contó con un estudio preliminar, que tuvo como finalidad evaluar el comportamiento de las variables consideradas para el análisis estadístico, así como la incidencia de los parámetros físico-químicos (pH, temperatura y oxígeno disuelto) sobre las mismas y un posible ajuste u optimización en la metodología propuesta. La etapa I, consistió en la evaluación de las variables: Mortalidad y crecimiento en longitud de las post larvas de gamitana de 5 días de edad, sembradas en recipientes de un litro de capacidad, a una densidad de 60 000 post larvas/m3 (densidad de producción) y adaptadas por 7 días a condiciones experimentales (Figura 17). 1 5 12 47 Etapa larval Adaptación Experimentación Figura 17. Resumen del procedimiento experimental - Etapa I SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  21

Etapa II: Se realizó el día 25 de marzo del 2012. Se utilizaron 4 grupos de 5000 post larvas cada uno (a una densidad de 1000 post larvas.L-1), de los cuales se tomaron muestras de 200 ml para ser procesadas por el software ImageJ 1.46 y, mediante la fórmula de Rothbard, determinar el coeficiente de variación (CV) de la estimación en contraste con la cuantificación real. Para la implementación se elaboró un protocolo (ver en resultados), con la finalidad de ser aplicado en el centro de investigación, posterior a las pruebas respectivas. 3.11.2.1. Obtención de post larvas Las post larvas de Colossoma macropomum, fueron obtenidas mediante reproducción inducida de progenitores criados en cautiverio en el CIQ – IIAP (Anexo 2). 3.11.2.2. Adaptación de las post larvas Durante el estudio preliminar, fue evaluado el proceso de adaptación de las post larvas a condiciones experimentales. Los ejemplares fueron seleccionados al quinto día de vida, se contaron y colocaron en grupos de 50 en las unidades experimentales. Finalmente, se llevó diariamente el seguimiento de mortalidad. Se encontró que a partir del quinto día de adaptación la supervivencia de las post larvas era constante. Se procedió a evaluar a partir del séptimo día de adaptación en la etapa experimental. 3.11.2.3. Alimentación de las post larvas La alimentación, durante el tiempo que duró la experimentación, fue a base de nauplios de Artemia sp (Figura 18). Se le suministró 1 ml diario de nauplios a una densidad promedio de 200 nauplios.ml-1. Figura 18. Nauplios de Artemia sp. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  22

3.11.2.4. Procedimiento de recolección de datos Para las evaluaciones de la etapa I, se realizaron muestreos diarios de mortalidad y semanales de crecimiento en longitud, desde el día 12 hasta el día 47 de edad. Individuos muertos IDENTIFICAR REGISTRAR RETIRAR a diario Figura 19. Muestreo de mortalidad El muestreo diario (Figura 19 y 20), consistió en identificar, registrar y retirar la cantidad de individuos muertos de cada unidad experimental; mientras que el muestreo semanal (Figura 21), consistió en contar al 50 % de los individuos de forma manual (método tradicional), utilizando pipetas; al otro 50 % de forma digital (método propuesto), utilizando, para ello, una regla metálica milimetrada de 100 mm, como patrón de medida, necesario para realizar la morfometría computarizada, una cámara fotográfica digital Panasonic DMCZS10 como herramienta de captura de imágenes digitales y el software ImageJ 1.46, para el procesamiento digital de imágenes; y midiendo al 100 % de los ejemplares por procesamiento digital. De esta manera se realizaron seis muestreos en la etapa experimental (a los 12, 19, 26, 33, 40, 47 días de edad de los ejemplares), los resultados de ambos métodos (manual y digital) fueron analizados estadísticamente utilizando la prueba T. Durante la etapa de validación, se tomaron diez muestras de 200 ml de cada una de los cuatro grupos a ser evaluados (Figura 21), se colocaron en recipientes transparentes de plástico y junto con una regla metálica milimetrada de 100 mm, como patrón de medida, se fotografiaron, para ser procesadas por el software ImageJ 1.46 y, mediante la fórmula de Rothbard, determinar la desviación estándar de la estimación en contraste con la cuantificación real. 3.11.2.5. Control de la calidad del agua del cultivo Se realizó limpieza diaria de cada unidad experimental, mediante extracción de la materia orgánica, valiéndose de una pipeta Pasteur de plástico de 3 ml. Asimismo, en cada control semanal se efectuó el cambio del 50 % de agua del sistema y se repuso el agua perdida por evaporación. Los parámetros físico-químicos del agua (T°, pH y oxígeno disuelto) de las unidades y diseño experimental, se registraron diariamente para la temperatura y semanalmente para el monitoreo del pH, con Potenciómetro WTW y el oxígeno disuelto con un oxímetro YSI 55 DISSOLVED OXYGEN. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  23

SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  24 IDENTIFICAR Diseño experimental a diario REGISTRAR RETIRAR Conteo digital Conteo manual Figura 20. Procedimiento de recolección de datos: Etapa 1 Unidad experimental (UE) INDIVIDUOS MUERTOS UE UE INDIVIDUOS VIVOS Crecimiento en longitud procesamiento digital de imágenes placa Petri procesamiento digital de imágenes Figura 21. Recolección de datos - Etapa II; Toma de muestras

3.11.3 Procesamiento y análisis de datos por pdi (procesamiento digital de imágenes) El pdi fue realizado utilizando el software ImageJ 1.46. El procedimiento se describe a continuación: 3.11.3.1. Apertura de la imagen La imagen fue abierta con y sin el uso de comandos: Para abrir una imagen usando los comandos: Se hizo clic en el comando file, seguido de open (Figura 22). FILE > OPEN Figura 22. Procedimiento de apertura de una imagen utilizando comandos SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  25

Para abrir una imagen sin usar los comandos: Se arrastró la imagen al programa (Figura 23). Figura 23. Procedimiento de apertura de una imagen sin utilizar comandos 3.11.3.2. Cuantificación El conteo por pdi en esta investigación, se realizó utilizando la herramienta multipoint, para lo cual, después de la apertura de la imagen, se inició haciendo clic derecho a la séptima herramienta de la ventana menú del software ImageJ 1.46 (Figura 24 a). Una vez seleccionada la opción de herramienta multipoint (Multi-point tool) (Figura 24 b), se procedió a hacer clic en cada individuo presente en la muestra e inmediatamente el programa creó puntos de selección y los enumeró (Figura 24 c). La cuantificación, a medida que fue realizada, fue registrada por el programa en la parte inferior de la ventana, debajo de la barra de herramientas (Figura 24 d). SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  26

a MULTIPOINT b d c crea puntos de selección y los enumera e f g Borrar puntos: Tecla “Alt” Mover puntos: Tecla “Ctrl” Resultados: Tecla “Ctrl” +M Figura 24. Cuantificación por procesamiento digital de imágenes: (a) Selección de herramienta multipoint; (b) Herramienta multipoint seleccionada; (c) Conteo de los ejemplares por puntos enumerados de selección; (d) Resultado inmediato del conteo; (e) Tabla de resultados (Tecla ‘Ctrl’ + M); (f) y (g) otras opciones útiles: borrar y mover puntos de selección. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  27

Los resultados del conteo (Figura 24 e) fueron mostrados opcionalmente, en una ventana adicional, luego de presionar la tecla ‘Ctrl’ + M. El color de la herramienta, pudo ser variado haciendo doble clic en la herramienta point del menú ventana del programa (Figura 25). Figura 25. Cambio de color de la herramienta multipoint: Hacer doble clic en la herramienta point y elegir cualquiera de los colores disponibles 3.11.3.3. Medición en longitud La medición en longitud de los ejemplares por pdi, se realizó utilizando la herramienta Set Scale, para lo cual, primero se debe calibrar la imagen y luego proceder a medir. Calibración de la imagen con la herramienta Set Scale: Para calibrar la imagen, después de la apertura de la misma, se seleccionó un patrón de medida conocido (Figura 26 a) y se procedió a abrir la herramienta, haciendo clic derecho al quinto comando de la fila de comandos de la ventana menú del software ImageJ 1.46 y seleccionando la herramienta (Figura 26 b). Inmediatamente apareció una ventana, donde se colocó los valores de la distancia conocida del patrón de medida seleccionado (Known distance) y la unidad de medida del mismo (Unit of length) (Figura 26 c, d). SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  28

SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  29 c d Figura 26. Calibración de la imagen con la herramienta Set Scale: (a) Selección del patrón de medida conocido; (b) Apertura de la herramienta; (c) Inicio de la ventana Set Scale; (d) Llenado de datos de distancia conocida y unidad de medida de la misma. b a

Medición de los ejemplares de la imagen con la herramienta Set Scale Para medir los ejemplares con la herramienta Set Scale, después de calibrar la imagen, se utilizó la quinta herramienta (Straight) de la ventana menú (Figura 27 a) y se seleccionó al individuo a analizar (27 b). Los valores de medición, aparecieron inmediatamente, con dos decimales, en la parte inferior del menú ventana del programa (Figura 27 c). Los resultados, también fueron mostrados, en una ventana adicional, con tres decimales, al presionar las teclas: ‘Ctrl’ + M a c b d Resultados: Tecla “Ctrl” +M Figura 27. Procedimiento de medición de los ejemplares utilizando la herramienta Set Scale: (a) Selección de la herramienta Straight; (b) Selección del individuo; (c) Resultado con dos decimales; (d) Tabla de Resultados (‘Ctrl’+ M) Cuando el individuo fue encontrado en posición curva, en lugar de utilizar la herramienta Straigth (Figura 27 a) para la medición, se utilizó la herramienta Segmented line, que se selecciona haciendo clic derecho en la herramienta Straigth y eligiendo dicha opción. Esta herramienta facilitó las mediciones de individuos en posiciones curvas. SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  30

 31 OBJETIVOS Objetivos Específicos Determinar el grado Determinar el grado ¿Qué efecto tendrá la implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana empleando el procesamiento de imágenes digitales en la productividad de una micro empresa acuícola? Problemas Específicos ¿De qué manera influye la manipulación durante el conteo en el grado de estrés de las post larvas? ¿De qué manera influye la manipulación durante el conteo en el grado de daños mecánicos de las post larvas? ¿Qué efecto tendrá la implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana empleando el procesamiento de imágenes digitales en la productividad de una micro empresa acuícola? Estimar la cuantificación de post larvas de gamitana empleando el procesamiento de imágenes digitales. Problema general hombre empleadas para el conteo de las post larvas. Disminuir las horas- de daños mecánicos de las post larvas ocurrido por manipulación en el conteo. de estrés de las post larvas por manipulación en el conteo. Objetivo General PROBLEMAS Matriz de consistencia La implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana disminuye las horas-hombre empleadas en el conteo. La implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana disminuye el grado de daños mecánicos ocurrido en el conteo. La implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana disminuye el grado de estrés producido en el conteo. Hipótesis Específicas La implementación de un sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana empleando el procesamiento digital de imágenes disminuye el error de estimación Hipótesis General HIPÓTESIS en el Variables Dependientes Porcentaje en cm longitud Crecimiento dad lidad (Tabla de calificación) (Ver Tabla 1 y 2) Puntaje de ca- Variable Independiente INDICADORES Índice de mortali- Dependiente “ Y” mecánicos ocurridos en el conteo. Grado de daños producido conteo. Grado de estrés Independiente “X” VARIABLES INSTRUMENTOS DE ESTUDIO Guías de observación (tablas) Matrices de evaluación TÉCNICAS Observación Muestreo Validación DISEÑO DE ESTUDIO Experimental y de validación NIVEL DE INVESTIGACIÓN Descriptivo Correlacional Inferencial TIPO DE INVESTIGACIÓN Cualitativa y cuantitativa MUESTRA 1000 post larvas POBLACIÓN 60 000 post larvas METODOLOGÍA SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE GAMITANA Colossoma macropomum (Cuvier, 1818) EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES FACULTAD DE OCEANOGRAFÍA, PESQUERÍA, CIENCIAS ALIMENTARIAS Y ACUICULTURA, UNFV – 2012

 32 cipiente después del conteo. Muchas post larvas caen fuera del re- vas en los recipientes de conteo por un tiempo prolongado. Se mantiene alta densidad de post lar- más de 1 minuto durante el conteo. Las post larvas se quedan sin agua por cipiente después del conteo. Algunas post larvas caen fuera del re- vas en los recipientes de conteo por un período de tiempo intermedio Se mantiene alta densidad de post lar- menos de 1 minuto durante el conteo. Las post larvas se quedan sin agua por piente después del conteo. Las post larvas no caen fuera del reci- vas en los recipientes de conteo por un breve período de tiempo. Se mantiene alta densidad de post lar- en todo momento. Las post larvas son contadas con agua DESCRIPCIÓN Máximo estrés 5 3 Mínimo estrés 1 PUNTAJE Tabla 1. Tabla de calificación de grado de estrés para conteo manual en el interior de la pipeta y se realizan múltiples intentos para sacarlas. Las post larvas se quedan atrapadas camente a los recipientes de conteo con un gran chorro de agua Las post larvas son devueltas brus- las pipetas Pasteur. Las post larvas son aplastadas con en el interior de la pipeta y se realizan algunos intentos para sacarlas. Las post larvas se quedan atrapadas recipientes de conteo con un ligero chorro de agua Las post larvas son devueltas a los presionadas con las pipetas Pasteur. Las post larvas son medianamente en el interior de la pipeta y se realizan pocos intentos para sacarlas. Las post larvas se quedan atrapadas recipientes de conteo con un mínimo chorro de agua Las post larvas son devueltas a los sionadas con las pipetas Pasteur. Las post larvas son ligeramente pre- DESCRIPCIÓN 5 Máximo daño 3 1 Mínimo daño PUNTAJE Tabla 2. Tabla de calificación de daños mecánicos para conteo manual

IV. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS “Todo lo que somos es el resultado de lo que hemos pensado; está fundado en nuestros pensamientos y está hecho de nuestros pensamientos”. Buda (600 AC; citado por Hamblin, 1992) Whitin you is the power Kier Se utilizó la prueba T, del Software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versión 18, para el análisis de datos. 4.1. Etapa I: Etapa Experimental 4.2.1 Mortalidad: En los ejemplares, en el método manual se registró una mortalidad del (25,50 + 0,35)%, mientras que en el método propuesto (4,60 + 1,69)% (Tabla 3). Tabla 3. Resultados de mortalidad (%) de los métodos manual (tradicional) y digital (propuesto) Media Desviación típ. Error típ. de la media Manual 25,5025 ,35027 ,17514 Digital 4,5975 1,68919 ,84459 Método Mortalidad (%) SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  33

4.1.2 Crecimiento: En los ejemplares, en el método manual se registró un crecimiento final en longitud total de (0,6696 + 0,0265) cm, mientras que en el método propuesto (0,7396 + 0,0453) cm (Tabla 4) (Anexo 6). Tabla 4. Resultados de crecimiento en longitud total (cm) de los métodos manual (tradicional) y digital (propuesto) Método Longitud (cm) Media Desviación típ. Error típ. de la media Manual ,66964 ,026542 ,002139 Digital ,73956 ,045269 ,002225 Las post larvas presentaron una longitud total inicial de (0,6359 + 0,0473) cm (ver Anexo5). 4.2. Etapa II: Etapa de Validación e implementación 4.2.1 Validación: El sistema para estimar la cuantificación de post larvas de gamitana Colossoma macropomum empleando el procesamiento digital de imágenes, presentó como coeficiente de variación 4,67 % en la etapa de validación, donde la media resultó: 208,50 post larvas y la desviación típica 9,75 (Ver tabla 5). σ CV= x .100 CV= 4,67 % Tabla 5. Estadísticos descriptivos N Mínimo (Min.) Máximo (Max.) Media Desv. típ. Validación 40 196,00 240,00 208,50 9,75337 N válido (según lista) 40 SISTEMA PARA ESTIMAR LA CUANTIFICACIÓN DE POST LARVAS DE “GAMITANA” Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), EMPLEANDO EL PROCESAMIENTO DIGITAL DE IMÁGENES  34

4.2.2 Implementación: Protocolo – Diagrama de operaciones Elaboración de un protocolo, a través de un diagrama de operaciones, para ser aplicado en la institución (Figura 28). DIAGRAMA DE OPERACIONES Método Gráfico Cuantificación de post larvas de gamitana Colossoma macropomum Empresa: Instituto de Investigaciones de la Amazonía Peruana (IIAP) Fecha: 16/ 11/ 2012 Dibujado por: Angela Berrocal Estanque de post larvas 15 minutos 5 minutos 1 minuto 1 Colocar en recipientes de 5 L 2-1 Tomar 3 muestras (200 ml c/u) y colocarlas en recipientes de plástico 3 Tomar foto Devolver post larv

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