Tesi Chiara Demma

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Published on October 1, 2014

Author: centroriccagioia1

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Tesi

1. UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PAVIA Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani” Laurea Magistrale in Biologia Sperimentale e Applicata Dipartimento di Scienze del Farmaco DETERMINAZIONE DEL PROFILO METABOLICO DI VINI BONARDA D.O.C. IN PUREZZA DELL’OLTREPÒ PAVESE Relatore: Prof.ssa Maria Daglia Correlatori: Prof.ssa Maurizia Dossena Dott.ssa Alessandra Leoni Tesi Sperimentale di Chiara Demma Anno Accademico 2013/2014

2. PARTE COMPILATIVA 1 INTRODUZIONE .............................................................................................................. 9 1.1 VITI E IDENTITÀ .................................................................................................... 10 1.1.1 I VITIGNI ........................................................................................................... 11 1.2 CROATINA STORIA E TRADIZIONE .................................................................... 12 1.2.1 AMPELOGRAFIA E FENOLOGIA .................................................................. 13 2 I POLIFENOLI ................................................................................................................. 14 2.1 FLAVANOLI O FLAVONOIDI ( C6–C3–C6 ) ......................................................... 15 2.2 ANTOCIANINE ........................................................................................................ 16 2.3 FLAVANOLI .............................................................................................................. 17 2.4 FLAVONOLI ............................................................................................................. 18 2.5 I NON FLAVONOIDI .............................................................................................. 19 2.5.1 ACIDI FENOLICI .............................................................................................. 19 2.5.2 GLI ACIDI IDROSSICINNAMICI (HCA) ....................................................... 19 2.5.3 GLI STILBENI ................................................................................................... 20 PARTE SPERIMENTALE INTRODUZIONE .................................................................................................................... 23 MATERIALI E METODI ......................................................................................................... 29 RISULTATI E DISCUSSIONE ................................................................................................ 31 CONCLUSIONI ....................................................................................................................... 54 ALLEGATO 1: Disciplinare ..................................................................................................... 63 ALLEGATO 2: Disciplinare ..................................................................................................... 70

3. PARTE COMPILATIVA

4. 9 1 INTRODUZIONE “ Ma per le vie del borgo dal ribollir de' tini va l'aspro odor de i vini l'anime a rallegrar.” Giosuè Carducci, San Martino, da Rime nuove (1861-1887). Il vino, come viene inteso comunemente, è prodotto attraverso la fermentazione del mosto d'uva (Vitis vinifera L ) e rappresenta la bevanda fermentata di frutta maggiormente diffusa. La storia della viticoltura inizia seimila anni fa nell'Anatolia orientale e nel Caucaso, e sotto l'Impero Romano completa la sua diffusione in Europa. Nel corso dei secoli, ove climaticamente era possibile coltivare la vite, si sono sviluppati modelli vitivinicoli assai differenti in relazione alle varietà coltivate e alle tipologie di vino prodotte. Ancora oggi la viticoltura moderna risente dell'impronta storico-geografica riconosciuta commercialmente nei vini a denominazione di origine. Sulla base dei dati archeologici, si ritiene che le popolazioni padane della tarda età del bronzo (secondo millennio a.C.) fossero grandi raccoglitrici di more, fragole e corniole, oltre che di uva di vite selvatica, che utilizzavano per produrre bevande vinose e conserve alcoliche. La trasformazione di questi frutti mediante la fermentazione era dovuta alla necessità di conservarli anche per lungo tempo prima del loro consumo evitando gli effetti nocivi per la salute umana, dovuti a contaminazioni batteriche e fungine. L’uva, inizialmente proveniente da piante spontanee, divenne una vera e propria coltivazione, man mano che le comunità umane si stabilirono nelle varie regioni, cominciando a formare centri abitati e a utilizzare strumenti come l’aratro. La viticoltura odierna è quindi il frutto del lungo cammino che si è sviluppato attraverso i secoli con il contributo di molte popolazioni europee. Nel corso della seconda metà dell'Ottocento la viticoltura lombarda attraversò una profonda crisi, conseguenza di una pluralità di fattori politici, economici, tecnologici, ma anche di cause biologiche quali la diffusione di parassiti introdotti dall'America: due malattie provocate da funghi (oidio, peronospora) e gli attacchi letali per gli apparati radicali da parte di un insetto (la filossera).1 Gli effetti benefici del consumo di vino sulla salute sono noti fin dall’antichità,“Bonum vinum laetificat cor hominum” (il buon vino rallegra il cuore dell'uomo) si legge nel Vecchio Testamento. Recenti studi epidemiologici dimostrano che la mortalità dovuta a malattie cardiovascolari diminuisce notevolmente dal nord al sud Europa ed è più bassa nel Mediterraneo che in altri Paesi sviluppati, in funzione della diffusione del consumo di vino. Il vino è un componente della dieta mediterranea e si pensa che un consumo moderato, soprattutto di vino rosso, possa avere effetti benefici contro le patologie cardiovascolari. I polifenoli, abbondanti specialmente nel vino rosso, grazie alle loro proprietà antiossidanti,

5. producono agenti cardioprotettivi come l'ossido nitrico (NO) e impediscono l'ossidazione delle lipoproteine a bassa densità (LDL).2a, b Lo studio della composizione chimica del vino riveste un ruolo importante per la caratterizzazione del prodotto e per il miglioramento della qualità. Con lo sviluppo di nuove tecniche analitiche, la conoscenza della composizione del vino è andata via via aumentando e ha permesso di individuare alcune complesse reazioni che avvengono durante le diverse fasi di vinificazione3,4 (Figura 1). Figura 1- Il Vigneto con i suoi filari5 10 1.1 VITI E IDENTITÀ Nella concezione attuale e più moderna del vino come espressione di un territorio nel suo insieme di valori artistici, paesaggistici e culturali, i vitigni autoctoni o tradizionali costituiscono un elemento di forte impatto perché sono i custodi di un patrimonio culturale locale che si presenta originale, unico, autentico. L’interesse per i vitigni autoctoni, perfino per i meno conosciuti, è molto diffuso, e si pone pertanto il problema di saper utilizzare, imparando a conoscere e facendolo proprio, un patrimonio biologico molto complesso. Esistono registri, aggiornati al 2000-2002, che elencano le varietà di vite coltivate in alcuni importanti Paesi viticoli mediterranei, come Italia, Francia, Grecia e Spagna, e riportano che i vitigni autoctoni da vino ufficialmente registrati nel nostro Paese, sono circa il doppio di quelli catalogati in Francia e in Grecia e quasi il triplo di quelli riportati per la Spagna. L’Italia, tra i numerosi altri Paesi viticoli europei, è forse il più ricco di “ampelo-diversità”. In

6. Italia sono stati censiti circa 2000 vitigni, alcuni rari e in via di abbandono che sono stati recuperati negli ultimi 15 anni nella parte Nord-Occidentale dell'Italia.6 Le ragioni di ciò sono numerose, ma tra le principali va ricordata la posizione geografica della nostra penisola che, protesa al centro del Mediterraneo, è sicuramente servita da ponte, cioè da zona di passaggio tra Nord e Sud, tra Est e Ovest, per le diverse specie vegetali mediterranee e per le loro varietà, portate dai numerosi popoli che hanno occupato o percorso il nostro Paese. 11 1.1.1 I VITIGNI L’uva è prodotta da piante appartenenti al genere Vitis. La famiglia delle Vitaceae, dal punto di vista sistematico, appartiene al regno delle Plantae, Phylum Magnoliophyta (angiosperme), classe Magnoliopsida (dicotiledoni), Ordine Rhamnales. Il genere Vitis è distinto in due sottogeneri principali dal punto di vista tassonomico, entrambi diploidi, Muscandinia ed Euvitis: al primo appartengono le viti con corredo cromosomico 2n=40 mentre al secondo quelle con 2n=38, suddivise in base all'origine di coltivazione. Mentre il sottogenere Euvitis è stato trovato nei depositi del Terziario sia in Asia che nel Nord America, Muscandinia emerge soltanto tra i materiali fossili del nord America, il che suggerisce che questa divisione si sia verificata prima del Quaternario cioè circa due milioni di anni fa. Pare che la famiglia delle Vitacee sia comparsa sulla terra circa 140 milioni di anni fa, ma in seguito alle glaciazioni molte specie di viti si estinsero, si salvò Vitis vinifera nell'area pontica (posta nel Caucaso tra il Mar Caspio e il Mar Nero) e oggi è coltivata in tutto il mondo. A sua volta si distingue in due sottospecie: una coltivata, chiamata Vitis sativa e una selvatica chiamata Vitis sylvestris. Il genoma di Vitis vinifera presenta un corredo cromosomico 2n=38 per un totale di 487 Mb equivalenti a circa 30.000 geni.7 L'Oltrepò Pavese è un'area della provincia di Pavia con superficie pari a circa 1.097 Km2 che deve il suo nome alla peculiarità, per un territorio Lombardo, di trovarsi a sud del fiume Po, in pieno Appennino Settentrionale, territorio geograficamente e morfologicamente molto simile a quello appartenente all'Emilia (Figura 2). La viticoltura in quest'area è nota sin dai tempi remoti e si è specializzata fino a caratterizzarne il paesaggio collinare diventando fulcro della produttività agricola del territorio. Con l'istituzione della Denominazione di Origine Controllata D.O.C. (Dpr, 12/07/1963, n.930, pubblicato in G.U. n.188, 15/07/1963) il territorio pose le basi per adeguarsi ai tempi e nel 1970 nacque ufficialmente la D.O.C. Oltrepò Pavese con il 98.72% di coltura specializzata in collina. 8 Nel 1961 nacque il "Consorzio di Tutela dei vini tipici e pregiati dell'Oltrepò Pavese" che identificò la zona collinare come l'unica adatta a dare uve di pregio ai fini della vinificazione. Nel DPR 8/8/2007, art.3, venne definita geograficamente l'area di coltivazione delle viti. La produzione

7. di Croatina venne incrementata in conseguenza alla resistenza all'oidio e all’abbondante resa e semplicità di vinificazione. 9 Oggi il vino Bonarda è predominante nell’Oltrepò orientale (4370 ettari). Figura 2 - Cartina della Lomellina, del Pavese e dell’Oltrepò Pavese10 1.2 CROATINA STORIA E TRADIZIONE La Croatina è fra i vitigni autoctoni pavesi quello sicuramente più noto al grande pubblico. Il vino che si ricava (in purezza o in uvaggio principalmente con uva rara e barbera) è il Bonarda Oltrepò Pavese (Figura 3). L’etimologia del termine croatina deriverebbe da “croatta” (cravatta) e indicherebbe che il vino ottenuto da croatina si beveva nei giorni di festa, quando si indossava la cravatta. In Oltrepò, in particolare nella zona di Rovescala, è considerato presente fin dal Medio Evo ma è solo a partire dalla fine del 1700 che se ne hanno tracce documentali. Numerose ricerche ampelografiche ne attestano la presenza e l’ampio utilizzo già nel corso dei due decenni 1870 e 1880, ad esempio. A seguito dell’arrivo di oidio (circa 1850), peronospora (1879) e fillossera (1897-1898) nella provincia di Pavia, la superficie occupata da questo vitigno ha subito un forte incremento, in quanto la Croatina è caratterizzata da una buona resistenza alle crittogame, nonché da una buona tolleranza ai portainnesti di vite americana indispensabili per sopravvivere all’attacco della fillossera. Alla fine del XIX secolo risultava essere il vitigno più diffuso in Oltrepò, in seguito questo primato è stato più volte ceduto al Barbera fino a quando, nel 1970, si è iniziato a produrre Bonarda, fatto questo che lo ha reso un vino gradevole e piacevole da bersi, capace di ottenere presto i favori del mercato, soprattutto nelle grandi città del nord Italia. Nel 2007 la superficie vitata a Croatina era di 4270, pari a quasi il 33% della superficie dell’intera D.O.C. Oltrepò Pavese.11 12

8. Figura 3 - Grappolo di Croatina 13 1.2.1 AMPELOGRAFIA E FENOLOGIA Il germoglio dell’uva Croatina è cotonoso, verde, biancastro sfumato di rosa, con foglioline apicali e di colore verde con sfumature bronzate (Figura 4). La foglia adulta è di media grandezza, pentagonale trilobata, a volte quinquelobata; la pagina superiore è glabra, l’inferiore aracnoidea (Figura 5). Il grappolo a maturità è grande, di forma piramidale talvolta alato, compatto, con peduncolo di media lunghezza. Figura 4 - Foglia di Croatina12 Figura 5 - Apice di Croatina L’acino è di media grandezza (2,3 g), sferoidale, con buccia consistente, pruinosa e di colore blu scuro, la polpa succosa e dal sapore astringente. La fioritura avviene normalmente tra la prima e la seconda decade di Giugno, seguita nella seconda metà di Agosto dall’invaiatura. La vendemmia della Croatina è effettuata generalmente durante la prima decade di Ottobre. Mostra buona resistenza all’oidio e, in misura minore, alla Botritys cinerea; soffre la peronospora e le gelate, viene coltivato in tutta la zona collinare e in particolare nei comuni di Rovescala, S. Damiano al Colle, Montù Beccaria, Stradella, Canneto Pavese, Broni e Castana. La Croatina è un vitigno di media vigoria e produzione che richiede terreni calcarei argillosi non troppo ricchi di potassio. La produzione è buona ma incostante, la maturazione è tardiva.

9. 14 2 I POLIFENOLI I polifenoli hanno un’influenza benefica sulla salute umana in quanto sono composti ad attività nutraceutica presenti negli alimenti e bevande di origine vegetale. Molte sono le proprietà salutistiche ascritte ai vini, le loro capacità antiossidanti sono in maggior misura attribuibili alla presenza di elevate concentrazioni di polifenoli, a cui appartengono i flavonoidi (come catechine e antociani) e gli stilbeni (come il resveratrolo). Flavonoidi e stilbeni sono presenti sia in forma libera che come glicosidi e, dopo l’assunzione con la dieta, vengono assorbiti a livello intestinale con un aumento della capacità antiossidante del sangue e un conseguente effetto sulla prevenzione di numerose patologie croniche quali alcune forme di cancro, malattie cardiovascolari e stati infiammatori. Per quanto riguarda la struttura chimica, sono caratterizzati dall'avere almeno un anello aromatico con uno o più gruppi ossidrilici come sostituenti (Figura 6). Figura 6 - Struttura generica dei flavonoidi. Le strutture individuate a oggi sono più di ottomila e sono ampiamente diffusi in tutto il regno vegetale. Esistono fenoli semplici, a basso peso molecolare, con un singolo anello aromatico e composti più complessi come i tannini; possono essere classificati in base al numero e alla disposizione degli atomi di carbonio e si trovano comunemente coniugati agli zuccheri e agli acidi organici. Si suddividono in flavonoidi e non flavonoidi. I primi sono caratterizzati da uno scheletro di difenilpirano, due anelli di benzene (anello A e B) uniti da una catena lineare a tre atomi di carbonio, in (Figura 7) sono illustrate le formule di struttura di alcuni flavonoidi. Figura 7A - Formule di struttura di alcuni flavonoidi: quercetina,miricetina.

10. Figura 7B - Formule di struttura di alcuni flavonoidi: laricitrina, astilbina. Più di 4000 flavonoidi sono stati individuati in frutta, verdura e bevande di origine vegetale come il tè e il vino, e la lista è in costante crescita. A seconda dello stato di ossidazione dell'anello piranosico centrale, possono essere a loro volta suddivisi in molte sottoclassi: flavonoli, flavoni, flavanoni, antociani, flavanoli, e anche isoflavoni. Tra i non flavonoidi, gli acidi fenolici, derivati dell'acido benzoico, come l’acido gallico e lo acido protocatecuico, e derivati dell’ acido cinnamico, che consistono principalmente di acido cumarico, caffeico e ferulico, seguiti dagli stilbeni, il cui principale rappresentante è il resveratrolo, che esiste nelle forme isomeriche cis e trans. I polifenoli sono presenti nei tessuti vegetali principalmente come glicosidi, associati a vari acidi organici o polimerizzati a formare complessi ad alto peso molecolare, come i tannini.13,14,15 Nel corso degli ultimi 20 anni, tali composti sono stati oggetto di studio per il loro potenziale coinvolgimento nella prevenzione di malattie croniche, quali malattie cardiovascolari, cancro, osteoporosi, diabete mellito, e malattie neurodegenerative. La loro azione protettiva è stata attribuita inizialmente alle loro proprietà antiossidanti, alla capacità di inibire o ridurre differenti enzimi, come la telomerasi 16 e ciclossigenasi17,18 o lipossigenasi19,20 e di recente, all'interazione con le vie di trasduzione del segnale.21,22Inoltre, è stata ampiamente studiata l'attività antimicrobica di polifenoli contro una vasta gamma di microrganismi presenti nei cibi di origine vegetale e nelle piante medicinali. Tra i polifenoli, i flavan-3-oli, i flavonoli e tannini hanno ricevuto più attenzione per la spiccata attività antimicrobica rispetto ad altri polifenoli. 2.1 FLAVANOLI O FLAVONOIDI ( C6–C3–C6 ) I flavonoidi sono caratterizzati da gruppi fenolici presenti nei due anelli aromatici, A e B, legati tra di loro da un eterociclo C. Il termine è stato introdotto nel 1952 da Geissman e Hinreiner, la radice “flavone” in latino significa giallo. L'espressione composti flavonoidi 15

11. indica generalmente l'intera classe dei fenoli vegetali, aventi struttura C6–C3–C6, ovvero due anelli aromatici legati da una catena di 3 atomi di carbonio (Figura 8). Figura 8- Formula di struttura di un flavonoide. In questa grande famiglia sono compresi antociani, flavonoli, flavanoli e flavanonoli. I flavanoli hanno come nucleo base la catechina e l'epicatechina; nelle bucce sono presenti quasi integralmente in forma polimerica. Ad eccezione dei flavanoli, la maggior parte dei polifenoli si trova nell'acino sotto forma di monomeri.23 Le caratteristiche dei differenti gruppi flavonoidi dipendono principalmente dall'anello eterociclico centrale che consente la classificazione dei vari flavonoidi in: flavanolo, flavandiolo, flavone, isoflavone, flavanone, flavanonolo,flavonolo, calcone, antocianidina. Nelle piante sono localizzati principalmente nelle cellule epidermiche, a livello dei vacuoli, e svolgono diverse funzioni: proteggono dalle radiazioni UV, difendono contro i microrganismi patogeni, contribuiscono alla germinazione del polline e svolgono una funzione cruciale nel richiamare insetti impollinatori coinvolti nella dispersione dei semi.24 Nell'uomo esercitano attività antimicrobica, antiallergica, antiaggregante, antinfiammatoria, antitumorale e antiossidante. Quelli più studiati sono gli antociani, i flavanoli e gli isoflavoni perché hanno potenziali effetti protettivi contro numerosi processi neurodegenerativi. 16 2.2 ANTOCIANINE Le antocianine rappresentano una grande classe di pigmenti naturali presenti nella parte aerea delle piante. Si trovano come forma glicosilata dello ione flavinio con sostituzioni di gruppi idrossilico e metossilico in diverse posizioni dell’anello B che sono responsabili del loro colore, infatti un aumento di sostituzioni di gruppi –OH, determina uno schift batocromico dal rosso al viola. Altro fattore importante è la natura dello zucchero legato allo scheletro della molecola, che contribuisce alla variazione della colorazione del pigmento (Figura 9).

12. Figura 9 - Struttura delle principali antocianine e le rispettive λ massime di assorbimento nel visibile.25 Il vino rosso è una bevanda in cui è presente una grande quantità di strutture diverse di pigmenti fenolici, sia nella loro forma originale che come derivati sotto forma di antocianine glicosilate ed esteri acilati, che reagiscono con composti fenolici e non fenolici durante il processo di vinificazione e invecchiamento, per formare nuove antocianine derivate.26 Altre fonti alimentari di antocianine sono bacche come il lampone, mirtillo, fragola, ribes nero e rosso, uva spina.27,28 Tuttavia, le antocianine sono presenti in molte altre piante ad uso alimentare, dai cereali (come la varietà pigmentata di mais (Zea mays L.) e riso nero (Oryza sativa L.), ad alcuni membri della famiglia Brassicaeae (come Brassica oleracea var. Capitata f. rubra, e Raphanus sativus L.), cipolla rossa (Allium cepa L.), le arance pigmentate (Citrus sinensis L.), tè Zijuan (una nuova cultivar di Camellia sinensis var. Kitamura, prodotto nella provincia di Yunnan della Cina) e canna da zucchero cinese (Saccharum sinensis Roxb.).29,30 A causa delle innumerevoli e potenziali proprietà salutistiche attribuite alle antocianine, l'influenza della digestione gastro-duodenale, l'assorbimento e il metabolismo di questi flavonoidi sono stati oggetto di molti studi.31,32 Riguardo al loro potenziale effetto positivo contro i processi neurodegenerativi, diversi studi suggeriscono che tali composti riescono ad attraversare la barriera emato-encefalica e a localizzarsi in aree deputate all’apprendimento e alla memoria, migliorando le funzioni cognitive.33 17 2.3 FLAVANOLI I flavan-3-oli sono la più grande sottoclasse di flavonoidi costituiti da monomeri, oligomeri e polimeri (Figura 10). Figura 10- Struttura chimica dei flavan 3-oli.

13. I monomeri più comuni sono (+)-catechina e (-)- epicatechina, mentre (-)- catechina e (+)- epicatechina sono meno diffusi. La presenza di quattro isomeri è dovuta ai due centri chirali in C2 e C3 (Figura 11). Figura 11- (+)-Catechina e (-)- Epicatechina. Sono spesso esterificati con acido gallico per dare i derivati gallato (come (- gallato)- epicatechina) e / o sono idrossilati sull’ anello B (cioè 3 ', 4' e 5 '), come (-) -epigallocatechina gallato. Tra gli oligomeri e polimeri, ci sono le pro-antocianidine. I flavan-3-oli si distinguono dagli antociani per il grado di ossidazione dell'anello( Figura12). Figura 12 - Alcuni flavan 3-oli.34 18 2.4 FLAVONOLI Sono un’altra importante classe di polifenoli, localizzati prevalentemente nelle bucce sia di uve rosse e bianche e contribuiscono alla stabilizzazione del colore rosso dei vini, attraverso fenomeni di co-pigmentazione35e alla percezione di amarezza,36 inoltre svolgono un potente ruolo antiossidante.37 Si trovano nelle bucce di uva sottoforma di 3-glicosidi (glucosidi, glucuronidi e galattosidi); i principali flavonoli presenti negli acini di uva sono la quercetina (3-O-glucoside e 3-O-glucuronide) e la miricetina (3-O-glucoside), ma anche altri composti, come il kaempferolo, isoramnetina, laricitrina e syringetina sono stati identificati come glucosidi.38,39,40Inoltre, è stato anche trovato kaempferolo sottoforma di 3-glucuronide e i recenti risultati hanno suggerito la presenza dei 3-galattosidi di kaempferolo e laricitrina come flavonoli minori.41

14. 19 2.5 I NON FLAVONOIDI I principali non-flavonoidi d’importanza alimentare sono gli acidi fenolici C6-C1, in particolare l’acido gallico, che è il precursore di tannini idrolizzabili, gli acidi idrossicinnamici C6-C3 e loro derivati coniugati e i polifenoli e stilbeni C6-C2-C6. 2.5.1 ACIDI FENOLICI Gli acidi fenolici sono noti anche come idrossibenzoati, la componente principale è l’acido gallico (Figura 13). Figura 13 - Acido gallico. Il nome deriva dalla parola francese “galle”, ovvero un rigonfiamento nel tessuto della pianta dopo l' attacco da parte di parassiti. L'acido gallico è l'unità base dei gallotannini. I tannini si legano alle proteine salivari, producendo un sapore astringente; una lieve astringenza migliora il sapore e la consistenza di un numero di alimenti e bevande, in particolare di tè e vini rossi. Molti tannini sono tanto astringenti da rendere i tessuti vegetali non edibili. 2.5.2 GLI ACIDI IDROSSICINNAMICI (HCA) Gli (HCA) sono il gruppo più abbondante di non flavonoidi presenti nel vino e nell’uva. Negli acini, polpa e buccia di V. vinifera troviamo: l’acido caffeoil-tartarico, p-coumaroil-tartarico e acido feroulil-tartarico i cui isomeri trans sono generalmente molto più abbondanti rispetto alle forme cis. 42 Gli acidi idrossicinnamici sono coinvolti nelle reazioni di imbrunimento del mosto e del vino,43 inoltre sono precursori di fenoli volatili aventi capacità antimicrobiche e antiossidanti. 44 L’acido cinnamico è un composto C6-C3 che viene convertito negli idrossicinnamati, i quali sono prodotti del gruppo dei flavonoidi, definiti come fenilpropanoidi. Gli HCA più comuni sono: l’acido p-cumarico, acido caffeico e ferulico (Figura 14), componenti comuni di frutta e verdura.

15. Figura 14 - Struttura degli acidi p- coumarico, caffeico, ferulico e cinnamico. 20 2.5.3 GLI STILBENI Grande attenzione è stata rivolta alle proprietà salutistiche degli stilbeni e in particolare al resveratrolo, lo stilbene più comune e al piceatannolo, un derivato naturale del resveratrolo, sintetizzato negli acini d’uva solo durante la maturazione, nonché ai derivati mono-glucosilati del reveratrolo quali il piceide e il resveratroloside. I membri della famiglia degli stilbeni hanno struttura C6-C2-C6, come i flavonoidi. Gli stilbeni sono fitoalessine, composti prodotti da piante in risposta agli attacchi fungini, agenti patogeni batterici e virali (Figura 15). Sono noti anche composti oligomeri del resveratrolo chiamati viniferine con azione antinfiammatoria decisamente superiore. Le principali fonti alimentari di stilbeni includono uva, vino, soia e arachidi. Il trans-resveratrolo presente nel vino rosso ha effetti cardioprotettivi; inoltre è stato dimostrato che è in grado di inibire l’ossidazione delle LDL, nella fase iniziale dell’aterosclerosi45 Figura 15 - Strutture degli stilbeni resveratrolo e resveratrolo-3-O-glucoside

16. PARTE SPERIMENTALE 21

17. 22

18. 23 INTRODUZIONE Questa tesi è finalizzata allo studio del Bonarda, vino prodotto nell’Oltrepò Pavese “Bonarda dell’Oltrepò Pavese DOC ” e approvato con DPR del 06.08.1970 G.U.27.10.1970. Questo vino, come riportato nel Disciplinare di produzione allegato alla tesi, può essere composto da uve: ▪ Croatina: dall’ 85% al 100% ▪ Barbera,Ughetta (Vespolina), Uva rara: congiuntamente o disgiuntamente, fino a un massimo del 15%. Tipologie di vino simili esistono anche in altre zone del Nord Italia, come riportato nel Registro Nazionale delle Varietà della Vite” edito dal Ministero delle Politiche agricole e forestali46. Il vino ottenuto dalla Croatina, in base al registro nazionale delle varietà della vite, risulta essere prodotto in Piemonte, Lombardia , Emilia Romagna e Sardegna (Figura 16), con i nomi commerciali per i vini a denominazione di origine controllata D.O.C. riportati in Tabella 1 e con i nomi commerciali per i Vini a indicazione geografica tipica IGT riportati in Tabella 2. Figura 16 - Cartina d’Italia con le zone di produzione47 Idonea alla coltivazione Idonea e consigliato

19. Tabella 1. Elenco dei nomi commerciali dei vini Bonarda D.O.C. VINI D.O.C. 1. BONARDA DELL’OLTREPO’ PAVESE 2. BRAMATERRA 3. BUTTAFUOCO DELL’OLTREPO’ PAVESE O 24 BUTTAFUOCO 4. CASTEGGIO 5. CISTERNA D’ASTI 6. COLLI DI PARMA 7. COLLI PIACENTINI 8. COLLI TORTONESI 9. COLLINE NOVARESI 10. COSTE DELLA SESIA 11. GUTTURNIO 12. OLTREPO’ PAVESE 13. PIEMONTE 14. SAN COLOMBANO AL LAMBRO O SAN COLOMBANO 15.SANGUE DI GIUDA DELL’OLTREPO’ PAVESE O SANGUE DI GIUDA 16. VALLI OSSOLANE Tabella 2. Elenco dei nomi commerciali dei vini Bonarda IGT. VINI IGT 1. BARBAGIA 2 BERGAMASCA 3. COLLI DEL LIMBARA 4 .COLLINA DEL MILANESE 5. DELLE VENEZIE 6. EMILIA O DELL’EMILIA 7. FORLÌ 8. ISOLA DEI NURAGHI 9. MARMILLA 10. NURRA 11. OGLIASTRA 12. PARTEOLLA 13. PLANARGIA 14. PROVINCIA DI NUORO 15.PROVINCIA DI PAVIA 16. RAVENNA 17. ROMANGIA 18. RONCHI 19. VARESINI 20. RUBICONE 21. SEBINO 22. SIBIOLA 23. TERRE LARIANE 24. THARROS 25. TREXENTA 26. VALLAGARINA 27. VALLE DEL TIRSO 28. VALLI DI PORTO PINO 29. VENETO 30.VERONA O PROVINCIA DI VERONA O VERONESE 31. ALTO MINCIO 32. PROVINCIA DI MANTOVA 33. QUISTELLO 34. SABBIONETA 35.TERRAZZE RETICHE DI SONDRIO Dalle tabelle riportate si può osservare che i vini ottenuti per vinificazione dell’uva Croatina, sia in purezza, sia con altre uve, scelte tra quelle provenienti dalla zona di produzione sono

20. molto numerosi. Per quanto riguarda i vini DOC, la sola provincia di Pavia utilizza la Croatina nella produzione di ben 5 tipologie di vini e i territori limitrofi (vicino Piemonte e Piacentino) producono altrettanti vini utilizzando la Croatina. Il Ministero per le Politiche Agricole e Forestali ha riconosciuto tuttavia, il Bonarda come vino proveniente solo dalla Provincia di Pavia. La Croatina è disponibile sottoforma di cloni che derivano dall’incrocio (solitamente per innesto) di due vitigni differenti, differiscono per alcuni aspetti fenotipici e vengono studiati e messi a punto per ottenere viti con maggiore resistenza alle malattie e vini con migliori caratteristiche organolettiche e maggiore resistenza all’invecchiamento, rispetto ai due biotipi incrociati. Attualmente il Ministero riconosce solo alcuni cloni, ottenuti e coltivati in purezza presso alcuni vivai specializzati tra cui anche il Centro di Riccagioia. S.C.p.a., Centro di Ricerca Formazione e Servizi della Vite e del Vino, con sede a Torrazza Coste (PV). L’elenco dei cloni ammessi per la produzione commerciale del Bonarda dell’Oltrepò Pavese è riportato nella tabella 3 sottostante. Tabella 3.elenco dei cloni ammessi per la produzione commerciale del Bonarda dell-Oltrepò Pavese. Codice Clone Data emanazione Gazzetta Ufficiale del 001 I - RAUSCEDO 2 1969-12-24 D.P.R. 1164/69 in G.U. 48 1970-02- 25 24 002 I - MI-CR 9 1976-04-29 G.U. 153 1976-06- 11 003 I - MI-CR 10 1976-04-29 G.U. 153 1976-06- 11 004 I - MI-CR 12 1976-04-29 G.U. 153 1976-06- 11 005 I - PC-BO-1 1979-11-16 G.U. 347 1979-12- 21 006 I - PC-BO-16 1979-11-16 G.U. 347 1979-12- 21 007 I - CVT 38 2009-01-12 G.U. 93 2009-04- 22 008 I - CVT 43 2009-01-12 G.U. 93 2009-04- 22 009 I - Cro 2 2014-05-15 G.U. 127 2014-06- 04 010 I - Cro 4 2014-05-15 G.U. 127 2014-06- 04 011 I - Cro 5 2014-05-15 G.U. 127 2014-06- 04

21. Tuttavia esistono molti altri cloni che da tempo vengono coltivati e studiati nella speranza di individuare caratteristiche organolettiche, nutraceutiche e colturali maggiormente vantaggiose per la produzione del Bonarda; tali cloni o presunti cloni (se la loro struttura genetica necessita di ulteriori verifiche o conferme) sono oggetto di studio a Riccagioia e vengono vinificati, in piccole quantità (100 l al massimo), ogni anno e degustati al termine del processo di vinificazione registrando di volta in volta le condizioni colturali, l’andamento del prodotto in cantina e le osservazioni fatte durante le varie degustazioni. In questa tesi sono stati presi in considerazione  N. 2 cloni di croatina già omologati (Cro 2 e Cro 5)  N. 2 cloni in attesa di omologazione (Cro 48 e Cro 63) 26  ed un presunto clone (Bonarda TQ). Le differenze tra i cloni riguardano alcuni aspetti della pianta e quindi dell’uva e non sono così facilmente riconducibili alle caratteristiche chimico-fisiche ed organolettiche del prodotto finito, tuttavia tutti i vini analizzati provengono dalla stessa vendemmia (2012) e hanno subito gli stessi trattamenti di cantina, a partire dalla macerazione sulle bucce, con durata pari a otto giorni per tutti i vini analizzati. Per questo motivo le differenze riscontrate nel vino sono da ascriversi solamente alle caratteristiche dell’uva di partenza. I vini oggetto di studio nella tesi sono stati selezionati perché prodotti con croatina in purezza, per escludere il contributo dovuto ad altre uve, ma in questo caso si è avuta la possibilità di conoscere le procedure di lavoro durante l’intero processo produttivo con la garanzia di ottenere un vino finito in cui le caratteristiche intrinseche, dipendevano esclusivamente dalle caratteristiche dell’uva di partenza. Il prodotto commerciale è in genere ottenuto da una miscela delle varietà di uva ammesse dal disciplinare e pertanto parte delle caratteristiche della Croatina vengono attenuate dalla presenza della Barbera, attenuando l’individualità del Bonarda. Inoltre, osservando le caratteristiche chimico-fisiche e organolettiche riportate dal Disciplinare di Produzione, si osserva che per il Bonarda è ammessa la vinificazione in molte tipologie di prodotto, dal momento che :

22. ▪ la sovrapressione può arrivare fino a 2,5 atm per il vino frizzante, ▪ la concentrazione di glucosio fruttosio varia da 0,1 g/l nel prodotto secco a 50 g/l per il Bonarda frizzante dolce; ▪ il titolo alcolometrico svolto può variare da 9 % v/v a 14 % v/v per i vini più corposi destinati all’invecchiamento. Le innumerevoli sfaccettature che questo vino può assumere nella sua produzione destinata alla grande distribuzione, ne hanno fatto un prodotto di massa, talvolta di basso valore commerciale e purtroppo spesso privo di una sua connotazione caratteristica, nonostante il suo indubbio valore organolettico. Il Bonarda dell’Oltrepò Pavese D.O.C. risulta un prodotto tipico della Provincia di Pavia, ma vini simili e con composizioni analoghe vengono prodotti anche nelle aree limitrofe, anche se con nomi differenti Gotturnio nel Piacentino e Cisterna d’Asti, in Piemonte, ad esempio. L’insieme di tutti questi fattori ha contribuito negli anni a rendere il mercato di questo vino, (con un destino comune a tanti altri in Italia), quanto mai debole e soggetto a subire le influenze della concorrenza e della contraffazione, fatto questo che ha determinato il progressivo livellamento dei prezzi al consumo, anche se i costi di produzione nel contempo sono in continuo aumento per un insieme di fattori . La ricerca svolta presso il Laboratorio di Chimica degli Alimenti e Nutraceutica del Dipartimento di Scienze del Farmaco dell'Università degli Studi di Pavia ha avuto lo scopo di determinare il profilo metabolico di cinque campioni di vino Bonarda in purezza, derivati da cloni differenti di Croatina. Da alcuni anni, il Dipartimento di Scienze del Farmaco collabora con Riccagioia SCPA, in un progetto di ricerca che ha la finalità di mettere a punto un protocollo di analisi specialistiche tali da costruire una carta di identità dei principali vini dell’Oltrepò Pavese, per ▪ individuarne le principali caratteristiche chimico-fisiche, ▪ analizzare le loro caratteristiche organolettiche, per descriverle anche dal punto di vista analitico, ▪ evidenziare le loro potenzialità sia dal punto di vista organolettico sia dal punto di vista salutistico ▪ e infine tutelare il prodotto difendendolo da eventuali contraffazioni, se non addirittura da frodi. La scelta di considerare il Bonarda come vino su cui sperimentare questo protocollo deriva essenzialmente dal fatto che è il vino più diffuso tra i vini dell’Oltrepò Pavese, di cui 27

23. rappresenta oltre il 40 % della produzione e che per questo motivo è possibile effettuare una valutazione statistica dei risultati ottenuta dall’applicazione del protocollo analitico al prodotto commerciale. Nella fase attuale della ricerca sono stati considerati dei campioni di Bonarda prodotti in cantine sperimentali per poter evidenziare caratteristiche analitiche relative alla sola uva croatina, dal momento che per il prodotto commerciale non è facile escludere la presenza di uve barbera nell’uvaggio finale. In questa tesi sono stati quindi considerati cinque campioni, ricavati da cloni di bonarda appartenenti alle collezioni di Riccagioia, vinificati in piccole o medie quantità (sotto i 5 hl), sicuramente in purezza per analizzare anche dal punto di vista organolettico, le caratteristiche di ciascun prodotto. I vini Bonarda considerati nella tesi rispondono completamente ai parametri indicati dal disciplinare di produzione e quindi l’attenzione è stata focalizzata, in questa ricerca, sul riconoscimento di polifenoli (flavonoidi, come catechine e antociani, stilbeni come il resveratrolo) strettamente legati alle capacità antiossidanti dei vini. Di alcuni campioni abbiamo anche dei dati analitici che alleghiamo a titolo di esempio (Tabella 4). Tabella 4.Dati analitici relativi ai cloni Cro2,Cro 48 e Cro 63. CLONE Alcool Ac. Fissa Ac. Volatile pH antociani totali 28 polifenoli totali Cro 2 14,7 5,1 0,30 3,52 1550 2906 Cro 48 15,9 5,1 0,37 3,53 916 2999 Cro 63 13,4 5,5 0,29 3,34 900 2988

24. 29 MATERIALI E METODI Reattivi:  Metanolo Sigma Aldrich (HPLC grade)  Acido formico 1M Sigma Aldrich  Acetonitrile Sigma Aldrich (LC grade)  Acqua Millipore grade Descrizione e preparazione del campione: I vini Bonarda D.O.C. dell’Oltrepò Pavese sono prodotti nella cantina sperimentale dell’azienda viti-vinicola Riccagioia. Questi vini, derivanti da micro e mesovinificazioni della cantina sperimentale sono stati selezionati per avere la garanzia di potere disporre di un vino prodotto esclusivamente con uva croatina in purezza e poter quindi escludere i possibili contributi derivanti da un utilizzo di uva barbera, sia nella fase di vinificazione sia nella fase di affinamento in cantina fino all’imbottigliamento. I vini analizzati, sono stati prodotti nella vendemmia precedente per potere meglio valutare la presenza di composti polifenolici ed antocianici in un vino “giovane” escludendo quindi i fenomeni ossidativi che normalmente avvengono durante l’invecchiamento. In questo studio sono stati analizzati 5 campioni di vino Bonarda : TQ, Cro2, Cro5, Cro63, Cro48. Ciascun campione è stato filtrato con filtri Millex-HV in PVDF con porosità di 0,45 e 0,22 μm e successivamente sottoposto ad analisi UHPLC-PDA-hESI-MSn. Analisi UHPLC-PDA-hESI-MSn : L’analisi dei campioni di vino è stata condotta utilizzando un sistema Jasco X-LC (Jasco,Easton,MD,USA) dotato di una pompa quaternaria, un detector UHPLC-PDA e uno spettrometro di massa a trappola lineare LTQ-XL (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) attraverso una sorgente h-ESI (Figura 17).

25. Figura 17- UHPLC-PDA-hESI-MSn La separazione è stata effettuata utilizzando una colonna Purospher® RP-18 (5 μm) LiChroCART® 250-4 (250 mm x 4 mm i.d., 5 μm) (Merck) con la corrispondente precolonna (Merck). La fase mobile è rappresentata da acqua acidificata con acido formico allo 0,1 % (eluente A) e acetonitrile (eluente B), il flusso è stato impostato a 1 mL/min e il volume d’iniezione a 5 μL. Il gradiente di eluizione è mostrato nella (tabella 5) : Tabella 5- Gradiente di eluizione del metodo analitico. 30 Tempo (min) Acqua acida (H3O+) Acetonitrile (CH3CN) 5 98 2 40 60 40 45 0 100 47 0 100 52 98 2 57 98 2 La temperatura del sistema è stata mantenuta a 24 °C. I cromatogrammi sono stati registrati a λ 280 nm (oltre che a 220, 254, 366, 520 nm); gli spettri sono stati registrati nel range 200- 650 nm per tutti i picchi. La trappola ionica ha operato nelle condizioni di data dependent, full scan (80-1500 m/z), zoom scan e in modalità MSn. Per ottenere gli ioni frammento è stata applicata un’energia di collisione del 35%; il voltaggio è stato tenuto a 3 kV per la ionizzazione negativa e 5 kV per quella positiva, la temperatura del capillare era 275 °C, il flusso di gas nella guaina era di 20 unità arbitrarie e l’ Auxiliary/sweep gas flow rate era di 17 unità arbitrarie.

26. 31 RISULTATI E DISCUSSIONE La ricerca svolta presso il laboratorio di Chimica degli Alimenti e Nutraceutica del Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università degli Studi di Pavia è stata finalizzata a determinare il profilo metabolico di cinque campioni di vino Bonarda in purezza: Bonarda TQ, Cro 2, Cro 5, Cro 63, Cro 48, derivati da cloni differenti di Croatina mediante un metodo messo a punto appositamente:UHPLC-PDA-hESI-MSn. Dal confronto dei cromatogrammi ottenuti, tenendo conto del tempo di ritenzione, dello spettro UV e spettro MS e MS2, è stato possibile identificare 68 composti di natura polifenolica, alcuni presenti in tutti i campioni di vino analizzati, altri presenti solo in alcuni. Più in particolare:  nel campione di vino Bonarda TQ sono state identificate 35 sostanze di cui 2 acidi organici (Tabella 7), 5 acidi idrossicinnamici (Tabella 8), 11 flavonoidi (Tabella 9) di cui 17 antociani (Tabella 10).  nel campione di vino Croatina Cro 48 sono state identificate 29 sostanze di cui 2 acidi organici (Tabella 11), 5 acidi idrossicinnamici (Tabella 12), 12 flavonoidi (Tabella 13) di cui 10 antociani (Tabella 14).  nel campione di vino Croatina Cro2 sono state identificate 27 sostanze di cui 2 acidi organici (Tabella 15), 3 acidi idrossicinnamici (Tabella 16), 12 flavonoidi (Tabella 17) di cui 10 antociani (Tabella 18).  nel campione di vino Croatina Cro 63 sono state identificate sostanze di cui 3 acidi idrossicinnamici (Tabella 19), 16 flavonoidi (Tabella 20) di cui 16 antociani (Tabella 21) nessun acido organico.  nel campione di vino Croatina Cro 5 sono state identificate sostanze di cui 2 acidi organici (Tabella 22), 6 acidi idrossicinnamici (Tabella 23), 21 flavonoidi (Tabella 24) di cui 7 antociani (Tabella 25). Nella seguente tabella sono riportati i numeri relativi ai composti presenti nei diversi cloni di Croatina (Tabella 6).

27. Tabella 6. Numeri relativi ai composti presentii nei vari cloni di Croatina. CLONE Acidi organici Acidi idrossicinnamici Flavonoidi Antociani Cro 2 2 3 12 10 Cro 5 2 6 21 7 Cro 48 2 5 12 10 Cro 63 0 3 16 16 TQ 2 5 11 17 Si può osservare che i flavonoidi sono la famiglia di composti numericamente più abbondante, seguiti dagli antociani, mentre acidi organici e acidi idrossicinnamici sono presenti con pochi composti. Ogni vino è stato analizzato come precentemente descritto e a seguito sono riportati il cromatogramma e gli spettri di massa relativi ai principali composti identificati. BONARDA TQ Figura- Cromatogramma total ion current, del campione di vino Bonarda TQ. Tabella 7. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi organici presenti nel campione di vino Bonarda TQ. ACIDI ORGANICI 32 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 7.81 169 125 Acido gallico 70.86 197 153 Acido siringico

28. Figura 10- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido gallico con tempo di ritenzione 7.81 min Figura 11- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido siringico con tempo di ritenzione 70.86 min. Tabella 8. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione di vino Bonarda TQ. ACIDI IDROSSICINNAMICI 33 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 13.47 311 149,179 Acido cis-caftarico 16.23 295 163,149 Acido cis-trans coutarico 17.36 325 193 Acido trans feruriltartarico 17.63 179 135 Acido trans-caffeico 45.97 194 193,134,149 Acido ferulico

29. Figura 12- Spettro MS e spettro MS2 del composto cis-caftaric acid con tempo di ritenzione 13.47 min. Figura 13- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido cis/trans coutarico con tempo di ritenzione 16.23 min. Figura 14- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido trans feruil tartarico con tempo di ritenzione 17.36 min. 34

30. Figura 15- Spettro MS e spettro MS2 del composto acido trans-caffeico con tempo di ritenzione 17.63 min. Figura 16- Spettro MS e spettro MS2del composto acido ferulico con tempo di ritenzione 45.95 min. Tabella 9. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai flavonoidi presenti nel campione di vino Bonarda TQ. FLAVONOIDI 35 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 11.17 305 179 Epigallocatechina 13.69 577 425,289 Procianidina dimero 15.21 447 401 Isoramnetina-3-O-glucoside 15.25 465 303 Diidroquercetina derivati 15.60 289 245,205,179 Epicatechina 15.84 865 577,289 Procianidina trimero 20.45 479 317 Miricetina-O-glucoside 22.81 493 331 Laricitrina-3-glucoside 23.15 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide 24.92 507 345 Siringetina-3-glucoside 25.86 389 227 Resveratrolo-trans-glucoside

31. Figura 17- Spettro MS e spettro MS2del composto epigallocatechina con tempo di ritenzione 11.17 min. Figura 18- Spettro MS e spettro MS2del composto procianidina dimero con tempo di ritenzione 13.69 min. Figura 19 Spettro MS e spettro MS2del composto isoramnetina 3-O-glucoside con tempo di ritenzione 15.21 min. 36

32. Figura 20- Spettro MS e spettro MS2del composto derivati della diidroquercetina con tempo di ritenzione 15.25 min. Figura 21- Spettro MS e spettro MS2del composto derivati della epicatechina con tempo di ritenzione 15.60 min. Figura 22- Spettro MS e spettro MS2del composto procianidina trimero con tempo di ritenzione 15.78 min. 37

33. Figura 23- Spettro MS e spettro MS2 del composto miricetina-3-glucoside con tempo di ritenzione 20.45 min. Figura 24- Spettro MS e spettro MS2 del composto laricitrina 3-glucoside con tempo di ritenzione 22.81 min. Figura 25- Spettro MS e spettro MS2 del composto quercetina 3-O-glucuronide con tempo di ritenzione 23.15min. 38

34. Figura 26- Spettro MS e spettro MS2 del composto siringetina 3-glucoside con tempo di ritenzione 24.92 min. Figura 27- Spettro MS e spettro MS2 del composto resveratrolo trans-glucoside con tempo di ritenzione 25.86 min. 39

35. Tabella 10. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli antociani presenti nel campione di vino Bonarda TQ. ANTOCIANI 40 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 2,93 603 543,471 Vitisina di Malvidina-3 acetil glucoside 7.09 493 331 Malvidina-3-glucoside 9.46 651 443,605 Malvidina-3-acetil glucoside-4 vinilfenolo 15.25 465 303,285 Delfinidina-3-O-glucoside 18.51 449 287 Cianidina-3-O-glucoside 18.52 517 355 malvidina-3-o-glu-acetaldeide 19.06 559 353,515 Vitisina tipoB di Malvidina-3- acetil glucoside 20.10 809 357,519,647 Malvidina-3-O-glucoside-8-etil- (epi)catechina 20.28 507 327,492 Delfinidina-3-acetil glucoside 20.47 479 317 Petunidina-3glucoside 20.70 1093 931 Piranomalvidina-3-glucoside PC 20.85 809 357,519,647 Malvidina-3-glucoside metilmetina cat. 22.20 625 579 Malvidina-3-glucoside-4vinil catecolammina 22.24 781 493,583 Malvidina-3 glucoside-cat 24.07 303 285 Delfinidina 24.19 955 665,357 Malvidina-3-cumaroil glucoside-metilmetina catechina 42.07 331 313 Malvidina Figura 28- Spettro MS e spettro MS2 del composto (Vitisina) malvidina 3 acetil glucoside con tempo di ritenzione 2.93min.

36. Figura 29- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-glucoside con tempo di ritenzione 7.09 min. Figura 30- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3- acetil glucoside-4 vinilfenolo con tempo di ritenzione 9.46 min. Figura 31- Spettro MS e spettro MS2 del composto delfinidina 3- O-glucoside con tempo di ritenzione 15.25 min. 41

37. Figura 32- Spettro MS e spettro MS2 del composto cianidina 3- O-glucoside con tempo di ritenzione 18.51min. Figura 33- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-O glucoside acetaldeide con tempo di ritenzione 18.52 min. Figura 34- Spettro MS e spettro MS2 del composto vitisina tipo B malvidina 3-acetil glucoside con tempo di ritenzione 19.06 min. 42

38. Figura 35- Spettro MS e spettro MS2del composto malvidina 3-O-glucoside-8-etil-(epi)catechina, con tempo di ritenzione 20.10 min. Figura 36- Spettro MS e spettro MS2del composto delfinidina 3-acetil glucoside con tempo di ritenzione 20.28 min. Figura 37- Spettro MS e spettro MS2del composto petunidina 3-glucoside con tempo di ritenzione 20.47 min. 43

39. Figura 38- Spettro MS e spettro MS2del composto piranomalvidina 3-glucoside PC con tempo di ritenzione 20.70 min. Figura 39- Spettro MS e spettro MS2del composto malvidina 3-glucoside metil metin catechina con tempo di ritenzione 20.85 min. Figura 40- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-glucoside 4-vinil catecolamina con tempo di ritenzione 22.20 min. 44

40. Figura 41- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-glucoside cat.con tempo di ritenzione 22.24 min. Figura 42- Spettro MS e spettro MS2 del composto delfinidina con tempo di ritenzione 24.07 min. Figura 43- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina-3-cumaroil glucoside metilmetin catechina con tempo di ritenzione 24.19 min. 45

41. Figura 44- Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina con tempo di ritenzione 42.07 min. CROATINA 48 Figura 45 - Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro 48. Tabella 11. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi organici presenti nel campione Cro48. ACIDI ORGANICI 46 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 3.10 133 115,87 Acido malico 20.93 197 153 Acido siringico

42. Tabella 12. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro48. ACIDI IDROSSICINNAMICI 47 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 13.22 311 149,179 Acido-cis/trans caftarico 16.17 295 163,149 Acido-cis/trans coutarico 17.36 325 193,235,265 Acido-trans-feruil tartarico 21.12 165 147 Acido diidrossicumarico 45.92 194 179,194,163 Acido ferulico Tabella 13. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai flavonoidi presenti nel campione Cro 48. FLAVONOIDI Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 10.18 593 425,407,289,467 (epi)gallocatechina (epi) catechina 11.14 305 179,219,261,165.125 Epigallocatechina 13.71 577 425,289 Procianidina B3 15.50 289 245,205,179 Catechina 15.72 865 287,289,299 Procianidina trimero 20.21 479 317,316 Miricetina-3-O-glucoside 20.71 493 317 Miricetina-3- glucuronide 22.74 493 331 Laricitrina-3- glucoside 23.19 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide 23.54 449 303,285,151 Astilbina 24.71 507 344 Siringetina-3- glucoside 25.89 389 227 Resveratrolo/trans glucoside

43. Tabella 14. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli antociani presenti nel campione Cro48. ANTOCIANI 48 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 2.92 603 543,471 Vitisina di Malvidina 3- acetil glucoside 15.23 465 303,285 Delfinidina-3-O-glucoside 18.34 449 287,303,285,269 Cianidina-3-glucoside 19.01 559 353,515 Vitisina-tipoB-di Malvidina3-acetil glucoside 20.33 507 327,492 Delfinidina-3-acetil glucoside 20.44 479 317 Petunidina-3-O-glucoside 22.25 781 493,583 Malvidina-3-glucoside-cat 22.80 493 331 Malvidina-3-glucoside 37.85 303 285,187 Delfinidina 41.99 331 313 Malvidina CROATINA Cro 2 Figura 46 - Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro2. Tabella 15. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi organici presenti nel campione Cro2. ACIDI ORGANICI Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 3..07 133 115,132,87 Acido malico 4.79 191 111,173 Acido citrico

44. Tabella 16. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro2. ACIDI IDROSSICINNAMICI 49 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 13.52 311 148,179 Acido-trans-caffeil tartarico 15.68 295 149,163 Acido Coutarico/trans 21.24 165 147 Acido-diidrossi-coumarico Tabella 17. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai flavonoidi presenti nel campione Cro2. FLAVONOIDI Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 10.24 593 425 (epi)gallocatechina(epi) catechina 13.88 577 425,289,451,407 Procianidina B3 15.29 465 303,285 Taxifolina-3-O-glucoside 18.07 289 245,205,179 Epicatechina 20.59 479 317 Miricetina-3-O-glucoside 20.75 493 317 Miricetina-3-glucuronide 22.77 493 331 Laricitrina-3-O-galattoside 22.96 463 301 Quercetina-3-O-galattoside 23.22 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide 23.67 449 303 Astilbina 24.80 507 344 Siringetina-3-O-glucoside 25.90 389 227 Resveratrolo-trans glucoside

45. Tabella 18. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli antociani presenti nel campione Cro2. ANTOCIANI 50 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 2.95 603 543,471 Vitisina di Malvidina 3-acetil glucoside 15.29 465 303,285 Delfinidina-3-O-glucoside 18.53 449 287,269 Cianidina-3-O-glucoside 19.11 559 353,515 Vitisina-tipoB-Malvidina- 3acetil glucoside 20.51 479 317 Petunidina-3-O-glucoside 22.63 625 579 Petunidina-3-p-Coumaroil glucoside 22.73 493 331 Malvidina-3-O-glucoside 22.96 463 301 Peonidina-3-O-glucoside 24.92 507 303 Delfinidina-3-O-acetil glucoside 42.05 331 313 Malvidina CROATINA Cro 63 Figura 47- Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro63. Tabella 19. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro63. ACIDI IDROSSICINNAMICI Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 21.27 165 119 Acido diidrossicumarico 36.62 329 167 Hexose-estere-dell’acido vanillico 45.90 193 179,194 Acido ferulico

46. Tabella 20. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai flavonoidi presenti nel campione Cro63. FLAVONOIDI 51 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 10.17 593 425 Epi-gallocatechina-epi 11.10 305 179 Epigallocatechina 13.72 577 425,289 Procianidina B3 15.44 289 245,205,179 Catechina 15.70 865 287,289 Procianidina trimero 15.98 447 401 Isoramnetina-3-O-glucoside 16.00 447 401 Camferolo-3-O-glucoside 20.49 479 317 Miricetina-3-O-galattoside 20.57 479 317 Miricetina-O-glucoside 22.26 781 601,583 Punicalina A 22.75 493 331 Laricitrina-O-glucoside 23.17 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide 23.62 449 303,285,151 Astilbina 24.88 507 345 Siringetina-3-glucoside 25.96 389 227 Trans-resveratrolo glucoside 36.06 227 185 Resveratrolo Tabella 21. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli antociani presenti nel campione Cro63. ANTOCIANI Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 2.97 603 543,471 Vitisina Malvidina-3-acetil glucoside 18.43 449 287 Cianidina 3-O-glucoside 18.52 517 355 Piranomalvidina 3-glucoside 19.04 559 353,515 Vitisina tipoB di Malvidina-3-acetil glucoside 19.07 561 399 Carbossipirano Malvidina-3-glucoside 20.57 479 317 Petunidina-3- glucoside 20.68 1093 931 Piranomalvidina-3-glucoside PC 20.86 809 357 Malvidina-3-glucoside-metilmetin catechina 22.26 781 493,583 Malvidina-3 glucoside catechina 22.54 625 579 Malvidina-3-glucoside-4-vinil-catecolamina 22.64 625 579 Petunidina-3-p coumaroil glucoside 22.83 493 331 Malvidina-3-O-glucoside 24.21 955 665,357 Malvidina-3-p coumaroil glucoside 4 etil catechina 24.93 805 643 Piranomalvidina 3-glucoside catechina 24.96 507 303 Delfinidina 3- O-acetil glucoside 42.07 331 313 Malvidina

47. CROATINA Cro 5 Figura 48 - Cromatogramma total ion current del campione di Croatina Cro5. Tabella 22. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi organici presenti nel campione Cro5. ACIDI ORGANICI 52 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta 7.87 169 125 Acido gallico 20.93 197 153 Acido siringico Tabella 23. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione Cro5. ACIDI IDROSSICINNAMICI Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 2.14 193 149 Acido ferulico 13.71 311 149,179 Acido-cis/trans caftarico 16.52 295 149,163 Acido-cis/trans coutarico 17.50 325 193 Acido-trans-feruil tartarico 17.53 179 135 Acido trans caffeico 21.24 165 147 Acido diidrossicoumarico

48. Tabella 24. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai flavonoidi presenti nel campione Cro5. FLAVONOIDI 53 Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 10.42 593 425 Epi-gallocatechina(epi)catechina 11.14 305 179,219,261,165,125 Epigallocatechina 13.96 577 425,289 Procianidina B3 14.10 577 425,289 Procianidina B1 14.15 577 425,289 Procianidina B4 14.30 577 425,289 Procianidina B2 15.25 465 303 Diidroquercetina derivati 15.50 289 245,205,179 Catechina 15.72 865 287,289,299 Procianidina trimero 16.00 447 401 Camferolo 3-O-glucoside 17.03 577 425,289 Prociandina B5 18.07 289 245,205,179 Epicatechina 20.54 479 317 Miricetina-3-O-galattoside 20.74 493 317 Miricetina 3-O-glucuronide 20.94 197 169,125 Etil-gallato 22.85 493 331 Laricitrina-3-O-galattoside 22.96 463 301 Quercetina-3-O-galattoside 23.31 477 301 Quercetina-3-O-glucuronide 23.68 449 303 Astilbina 24.91 507 345 Siringetina-3-O-glucoside 25.90 389 227 Resveratrolo trans glucoside Tabella 25. Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli antociani presenti nel campione Cro5. ANTOCIANI Tempo di ritenzione (min) m/z [ M+H]+ MS² m/z Struttura proposta 18.81 517 355 Piranomalvidina-3 glucoside 18.95 561 399 Carbossipirano-Malvidina-3- glucoside 20.51 479 317 Petunidina-3-O-glucoside 20.88 809 357,319,647 Malvidina-3-glucoside metilmetin catechina 22.73 493 331 Malvidina-3-O-glucoside 24.27 955 665,357 Malvidina-3-p-coumaroilglucoside 4-etil catechina 24.92 507 303 Delfinidina-3-O-acetil glucoside

49. 54 CONCLUSIONI La ricerca condotta sui campioni di vino Bonarda TQ, Croatina Cro 2, Cro 5, Cro 48, Cro 63, ha permesso di ottenere per ciascuno di essi una parziale caratterizzazione chimica da cui emerge la presenza di almeno 162 prodotti appartenenti ai seguenti gruppi :  acidi organici  acidi idrossicinnamici  flavonoidi , di cui antociani In tutti i vini analizzati, con eccezione del solo clone Cro 5, è stata identificata anche la β- alanina, proveniente forse dai lieviti utilizzati durante la fermentazione. ACIDI ORGANICI Il Bonarda TQ e il clone Cro 5 presentano analogie in quanto contengono entrambi sia l’acido gallico sia l’acido siringico, che è un estere metilico del primo composto. Si differenzia il clone Cro 2 che possiede solo gli acidi malico e citrico, mentre il clone 48 oltre all’acido siringico, contiene anche acido malico. Acido gallico, acido siringico, acido malico e acido citrico sembrano completamente assenti nel clone Cro 63( Tabella 26). Tabella.26 Acidi organici presenti nei vari campioni di vino. ACIDI ORGANICI COMPOSTO Bonarda TQ Cro 2 Cro 5 Cro 48 Cro 63 Acido gallico √ √ Acido siringico √ √ √ Acido malico √ √ Acido citrico √ ACIDI IDROSSICINNAMICI I vini Bonarda TQ e quelli ottenuti dai cloni Cro 5 e Cro 48 presentano il maggior numero di composti appartenenti alla famiglia degli acidi idrossicinnamici, pur con differenze tra i vini perché nel campione Bonarda TQ manca l’acido diidrossicumarico e nel clone Cro 48 manca l’acido trans-caffeico. I vini ottenuti dai cloni Cro 2 e Cro 63 sono invece caratterizzati da un minor numero di acidi idrossicinnamici, tre composti per ciascun vino tra cui solo l’acido diidrossicumarico è comune tra i due (Tabella 27).

50. Tabella 27. Acidi idrossicinnamici presenti nei vari campioni di vino. ACIDI IDROSSICINNAMICI 55 COMPOSTO Cro TQ Cro 2 Cro 5 Cro 48 Cro 63 Ac. cis-caftarico √ √ √ Ac. cis-trans coutarico √ √ √ √ Ac.trans-feruriltartarico √ √ √ Ac. trans-caffeico √ √ Ac. ferulic √ √ √ √ Ac. diidrossicumarico √ √ √ √ Ac. trans caffeil- tartarico √ hexose estere dell’acido √ vanillico FLAVONOIDI Il vino che presenta la maggiore abbondanza numerica di flavonoidi è quello ottenuto dal clone Cro 5 in cui sono presenti tutti i composti in elenco con eccezione di procianidina dimero, isoramnetina 3-O glucoside, diidroquercetina derivati, miricetina-O-glucoside, laricitrina 3-glucoside, quercetina 3-O glucoside, siringetina 3-glucoside, punicalina A, resveratrolo, astilbina. Interessante osservare anche che il vino ottenuto dal clone Cro 5 è l’unico a contenere tutte le procianidine (procianidina B1, B2, B3, B4, B5 e procianidina trimero). Differente è il contenuto in flavonoidi degli altri vini che sono accomunati dal fatto che sono stati osservati tra 11 e 16 flavonoidi in ciascuno di essi, e che presentano tutti i seguenti composti: acido diidrossicumarico, quercetin 3-glucoronide, miricetina 3-glucoside, laricitrina 3-glucoside, siringetina 3-glucoside, (epi)gallocatechina (epi)catechina. Interessante osservare anche che il resveratrolo in forma libera è presente solo nel vino ottenuto dal clone C 63, mantre la sua forma glucosidata manca solo nel vino ottenuto dai cloni Cro 2 e Cro 48 (Tabella 28).

51. Tabella 28. Flavonoidi presenti nei vari campioni di vino FLAVONOIDI COMPOSTO Bonarda 56 TQ Cro 2 Cro 5 Cro 48 Cro 63 Epigallocatechina √ √ √ Procianidina dimero √ Isoramnetina3-O-glucoside √ √ Diidroquercetina derivati √ Epicatechina √ √ √ Procianidina trimero √ √ √ Miricetina-O-glucoside √ √ √ Laricitrina 3-glucoside √ √ Quercetina 3-O-glucoside √ √ Siringetina 3-glucoside √ √ Resveratrolo transglucoside √ √ √ (epi)gallocatechina(epi) catechina √ √ Procianidina B3 √ √ √ Taxifolina-3-O-glucoside √ Miricetina-3-Oglucuronide √ √ Laricitrina-3-O-galattoside √ √ Quercetina-3-O-galattoside √ √ Astilbina √ √ Siringetina-3-O-glucoside √ √ Catechina √ √ Camferolo 3-O-glucoside √ √ Miricetina 3-O-galattoside √ √ Punicalina A √ Resveratrolo √ Quercetina3-O-glucuronide √ √ Astilbina √ Diidroquercetina derivati √ Prociandina B5 √ Etil-gallato √ Procianidina B1 √ Procianidina B4 √ Procianidina B2 √ ANTOCIANI Molto interessante è l’osservazione sulla distribuzione degli antociani nei vari vini. Il Bonarda TQ, proveniente da un presunto clone in fase di studio, per verificarne le caratteristiche fenologiche, presenta una grandissima abbondanza numerica di antociani. A questo proposito si osserva che mancano solo la peonidina e pochi derivati della malvidina. Il vino ottenuto dal clone Cro 63 è quello che presenta dopo al Bonarda TQ la maggior abbondanza numerica di

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