Sofia University - MS thesis presentation

50 %
50 %
Information about Sofia University - MS thesis presentation

Published on January 13, 2009

Author: delyanrusev

Source: slideshare.net

Description

Research on the biosynthetic activity of recombinant strains obtained through protoplast fusion of morphologic types of the mutant strain Streptomyces ambofaciens ATCC 15154 – producers of spiramycin.

Софийски Университет “ Св. Климент Охридски” Биологически факултет, София Катедра”Биотехнология” ДИПЛОМНА РАБОТА МАГИСТРАТУРА : ”Индустриални биотехнологии” Тема: Получаване на фузантни щамове чрез протопластиране и фузия между морфологични типове на Streptomyces ambofaciens ATCC15154 - продуценти на спирамицин Ръководител катедра: Научен ръководител: доц., д-р А . Атев доц., д-р В . Балуцов ДИПЛОМАНТ: Делян Русев Русев Ф № 38143

Антибиотици-определение и класификация Антибиотиците са вторични метаболити от микробен произход, както и техните полусинтетични производни, които в минимални концентрации притежават висока биологична активност, изразяваща се в задържане развитието или убиване на определени микро-организми или други клетки . Антибиотиците се биосинтезират предимно от три типа микроорганизми: актиномицети, плесенни гъби и бактерии . Антибиотиците се класифицират в отделни групи според вида на продуцента, спрямо механизма и спектъра им на действие, но най-рационална и точна е химичната класификация.

 

Приложение на антибиотиците Хуманна медицина Ветеринарна медицина Аграрно стопанство Биохимични изследвания Идентификация на микробни щамове

МАКРОЛИДНИ АНТИБИОТИЦИ Макролидните антибиотици са голяма и важна група структурносходни съединения синтезиращи се предимно от видовете на род Streptomyces , разред Actinomycetales. Обща характеристика на повечето макролидни антибиотици е наличието на високозаместен 12-, 14-, или 16-членен макроцикличен лактонен пръстен съставляващ агликоновия компонент , към който посредством гликозидна връзка се свързват неутрални и/или аминозахари. Типичните лактонни пръстени и местата за присъединяване на захарите към тях са следните:

СИНТЕЗ НА МАКРОЛИДНИТЕ АНТИБИОТИЦИ Агликоновата част се биосинтезира по т. нар. поликетиден път посредством свързването на ацетатни, пропионатни и бутиратни субединици на принципа глава-опашка. Захарите от гликоновата част са биотрансформационни производни на глюкоза, а разклоняващите N- и C- метилни групи се получават от метаболитно разграждане на метионин.

ME ХАНИЗЪМ НА ДЕЙСТВИЕ НА МАКРОЛИДНИТЕ АНТИБИОТИЦИ Макролидите инхибират растежа на много Грам (+) и някои Грам (-) бактерии. Обикновено активността на 16-членните макролиди е по-висока. Много макролиди са активни спрямо пеницилин-устойчиви стафилококи, микоплазми. Някои от тях са активни и срещу Грам (-) коки, спирохети, рикетсии и големи вируси. Има и макролиди с антипротозойна активност, които се характеризират с много ниска активност или с липсата си на такава в еукариотните клетки . Бактериостатичният ефект на макролидните антибиотици се дължи на способността им да инхибират селективно белтъчния синтез на ниво мРНК – свързват се с 50 S субединицата на прокариотните рибозоми.

СПИРАМИЦИН-ОТКРИВАНЕ И СТРУКТУРА За първи път спирамицинът е бил получен през 1954 година във френските лаборатории “Rhone Poulenc” при дълбочинно култивиране на Streptomyces ambofaciens, изолиран от почвени образци от северна Франция. Установено е, че е съставен от три сходни 16-членни макоролидни антибиотика в различно процентно съотношение, съответно обозначени като спирамицин 1, 2 и 3, които се различават само по вида на субституента R в агликоновата част . По UV характеристиките си (UVmax =232nm) принадлежи към групата на 16-членните макролидни антибиотици, съдържащи: -С=С-С=С-С(ОН)- (α, β, γ, δ – ненаситен алкохол) хромофор. По броя на захарните остатъци се отнася към тригликозидните типове – съдържа една неутрална (L-микароза) и две амино захари (D-микаминоза и D-форозамин)

Структурна формула на спирамицин

Антибактериален спектър и механизъм на действие на спирамицин Антибактериалният спектър на спирамицина включва Грам (+): Str.pyogenes, Str.pneumoniae, S.aureus, S.epidermidis и Грам (-): N.meningitidis, H.influenzae, B.pertussis . Прилага се при стрепто- и пневмококови, както и при стафилококови инфекции. Използва се при тонзилити, рино-фарингити, синузити, отити и в стоматологичната практика при пародонтоза, стоматит, гингивит. Механизмът му на действие е свързан с блокирането на рецепторните места за тРНК на рибозомите на микроорганизмите, в резултат на което се потиска белтъчната синтеза.

Методи за получаване на свръхпродуценти Обикновено само част от потенциалните възможности, заложени в генома на продуцентите, се реализира при промишленото производство на биологичноактивни вещества. За повишаване на добива на желания продукт в практиката най-често намират приложение два подхода: 1. Създаване на оптимални условия за култивиране, които обуславят максимална биосинтетична изява на продуцента; 2. Получаване на мутанти с изменен метаболизъм. Конкретните методи, които се прилагат при втория подход, са свързани с провеждане на индуциран мутагенез, плазмидна и електротрансформация, използването на фагови вектори, получаване на протопласти, тяхното регенериране и фузия.

ПРОТОПЛАСТИРАНЕ – СЪЩНОСТ НА МЕТОДА Протопластирането е ефективен метод за вътре- и междувидова генетична рекомбинация и конструиране на щамове с изменени биосинтетични свойства. Получаването на протопласти при стрептомицетите става възможно, когато се установява, че тяхната клетъчната стена, подобно на грамположителните бактерии, се лизира от лизозим (N - ацетилмурамид-гликанохидролаза ). В резултат на специфичното сродство на лизозима към β-гликозидните връзки в негово присъствие хетерополимерните вериги на гликопротеидите на клетъчната стена се накъсват на дизахаридни фрагменти. Процесът на лизис на стрептомицетния мицел се ускорява при добавяне на свободни аминокиселини (глицин, лизин или треонин) в средата за предварително култивиране.

Строеж на пептидогликановия слой при Грам (+) бактерии Структурен модел на лизозим

РЕГЕНЕРАЦИЯ – СЪЩНОСТ НА ПРОЦЕСА В хромозомата на протопластите се съдържа цялата информация, необходима за регенерация на клетъчната стена, поради което при подходящи условия те ревертират в мицелна форма с характерната за вида морфология. Регенерацията на протопластите изисква допълнителен комплекс от ензими, които липсват при нормално развитие на културата. Състоянието под формата на протопласт е екстремно за клетката и усложненото развитие, загубата на голямо количество мезозомален материал при формирането на протопласта, както и реверсията на мицела могат да доведат до изменения в регулацията и експресията на гените и дори до експресия на “мълчащи” гени и да стимулират присъщата на стрептомицетите генетична нестабилност.

ПРОТОПЛАСТИРАНЕ – ЗНАЧЕНИЕ НА МЕТОДА Протопластирането води до изменение на продуциращата способност практически на всички изследвани щамове-продуценти на различни групи антибиотици. Възможна е появата на варианти както със значително увеличена, така и със снижена или нулева активност. Освен върху антибиотичната активност протопластира - нето влияе и върху състава на компонентите на антибиотичния комплекс .

ФУЗИЯ – СЪЩНОСТ НА МЕТОДА Под действието на полиетиленгликол (PEG) протопластите могат да претърпят фузия (сливане). Предполага се, че полиетиленгликолът снижава повърхностния заряд на протопластите, което създава условия за тесен контакт и слепване на мембраните. На мястото на слепването те се разкъсват и съдържимото на двата протопласта се обединява. При регенерация след фузия на стрептомицетни протопласти се образуват рекомбинанти с честота, която превишава с 3-4 порядъка вероятността за тяхната поява при конюгационния способ на генетичен обмен.

ФУЗИЯ – ЗНАЧЕНИЕ НА МЕТОДА Протопластната фузия се използва за създаване на хибридни щамове, способни да синтезират нови антибиотици. Освен като резултат от сливането на генетичния материал на родителските култури, получаването на антибиотици с друга химическа природа може да бъде следствие и на дерепресия или активация на регулаторен участък от “мълчащи” гени. Наблюдаваната загуба на способността да образуват изходните антибиотици може да бъде предизвикана и от изменение в експресията на регулаторните гени или изменение в структурните гени на съответните биосинтетични пътища у фузантите.

Streptomyces ambofaciens- продуцент на спирамицин Продуцентът на спирамицин, Streptomyces ambofaciens , принадлежи към род Streptomyces, разред Actinomycetales - голяма и широко разпространена група Грам (+) бактерии. Конкретният щам, ко й то е използван за експерименталната работа е мутант - Streptomyces ambofaciens ATCC15154 , получен след UV третиране на щам Streptomyces ambofaciens ATCC23877 . Общата дължина на генома на този щам е приблизително 8235 kb и включва една линейна молекула хромозомна ДНК с високо съдържание на G и C (G+C%=70-74%) и два плазмида: pSAM1 (80 kb), съществуващ под формата на свободна извънхромозомна ковалентно затворена кръгова молекула ДНК и pSAM2 (11.1 kb), съществуващ под формата на интегрирана в хромозомата ДНК секвенция. Предполага се, че pSAM1 участва в регулацията на синтезата на спирамицин

Морфологични типове на S. ambofaciens ATCC 15154 върху овесена среда

Цел и задачи: Цел: Получаване на фузантни щамове чрез протопластиране и фузия между морфологични типове на Streptomyces ambofaciens ATCC15154 - продуцент и на спирамицин. За осъществяване на така поставената цел бяха формулирани следните задачи: Избор на морфологични типове на Streptomyces ambofaciens ATCC15154 отговарящи на критерии за максимална антибиотична активност и морфологична стабилност. 2. Протопластиране на избраните морфологични типове. 3. Фузия между получените протопласти и регенерация на клетъчната стена на фузантите. 4 . Морфологична характеристика на фузантите. 5 . Проучване на радиалния растеж на фузантните щамове. 6. Изследване на антибиотичната активност на фузантите и стабилността на признака при препасажиране.

Цел и задачи:

Цел: Получаване на фузантни щамове чрез протопластиране и фузия между морфологични типове на Streptomyces ambofaciens ATCC15154 - продуцент и на спирамицин.

За осъществяване на така поставената цел бяха формулирани следните задачи:

Избор на морфологични типове на Streptomyces ambofaciens ATCC15154 отговарящи на критерии за максимална антибиотична активност и морфологична стабилност.

2. Протопластиране на избраните морфологични типове.

3. Фузия между получените протопласти и регенерация на клетъчната стена на фузантите.

4 . Морфологична характеристика на фузантите.

5 . Проучване на радиалния растеж на фузантните щамове.

6. Изследване на антибиотичната активност на фузантите и стабилността на признака при препасажиране.

 

 

Вегетативен мицел на втори морфологичен тип след 48-часово култивиране в Т SB среда Вегетативен мицел на пети морфологичен тип след 48-часово култивиране в Т SB среда

Мицел от пети морфологичен тип след 24-часово култивиране в Т SB среда с 0.4 % глицин Мицел от втори морфологичен тип след 24-часово култивиране в Т SB среда с 0.4 % глицин

Протопласти на Streptomyces ambofaciens ATCC15154 получени след 60-минутна инкубация с лизозим

 

 

M орфологични типове подложени на протопластиране и фузия Морфология на получените фузанти Фузант F 1- 5 Фузант F 1- 23 ІІ тип V тип

Зависимост на радиалния растеж от продължителността на култивиране на фузантните щамове F1- 5 и F1 - 23 Зависимост на радиалния растеж от продължителността на култивиране на II и V морфологичен тип

Сравнителният анализ на фузантите и изходните морфологични типове по отношение на радиалния растеж показва, че фузантните щамове растат приблизително два пъти по-бързо. По-голямата скорост на радиален растеж предполага по-бързото натрупване на биомаса.

Изолираните 36 фузанта бяха тествани за антибиотична активност по метода на агаровите блокчета спрямо тест-микроорганизъм Bacillus subtilis ATCC6633. При нито един не беше отчетено наличието на зони на инхибиране на растежа на тест-микроорганизма, т. е. изолираните фузантни щамове не проявяват антибиотична активност. С отчитането на този резултат отпадна необходимостта от проверка за стабилност на признака при препасажиране. Най-вероятното обяснение на липсата на антибиотична активност е възможността в процеса на протопластиране и фузия да са настъпили изменения в регулаторните гени, отговорни за контролиране на синтеза на спирамицин или в самите структурни гени, кодиращи антибиотика. Регулаторни гени за синтез на спирамицин са открити и в малък плазмид pSAM1 (80 kb), който лесно може да бъде загубен в процеса на сливане между протопластите. ИЗСЛЕДВАНЕ НА АНТИБИОТИЧНАТА АКТИВНОСТ НА ФУЗАНТИТЕ

Изводи В резултат от фузията между протопластите на втори и пети морфологични типове на Streptomyces ambofaciens ATCC15154 и последвалата регенерация на клетъчната стена на фузантните щамове могат да се направят следните изводи: 1. Изолираните 36 фузанта формират големи колонии, с диаметър 21-31 mm; с характерна морфология, отличаваща се от тази на изходните типове използвани в експериментите. 2. Фузантните щамове имат приблизително 2 пъти по-висока скорост на радиален растеж, която предполага и по-бързото натрупване на биомаса. 3. Фузантите не показват антибиотична активност спрямо тест-микроорганизъм Bacillus subtilis ATCC6633 . Най-вероятното обяснение на този резултат може да се търси в настъпили промени в генома, засягащи регулаторни или структурни гени, кодиращи синтеза на спирамицин.

Add a comment

Related presentations

Related pages

Sofia University - MS thesis presentation ...

Research on the biosynthetic activity of recombinant strains obtained through protoplast fusion of morphologic types of the mutant strain Streptomyces ...
Read more

Sofia University

Give To ITP Sofia. Sofia University Annual Fund; ... MS Computer ScienceApply Now for Winter! ... Sofia University offers a variety of Undergraduate, ...
Read more

Faculty of Philosophy / Faculties / The University / Home ...

Congratulations on your arrival to the Faculty of Philosophy of Sofia University! ... email to Ms. Dilyana Pavlova at ... with a defense of an MA thesis.
Read more

Plamen Fiziev (Joint Institute for Nuclear Research, Dubna ...

Plamen Fiziev of Joint Institute for Nuclear Research, ... Sofia University. MS thesis: ... Sofia University. Duties: ...
Read more

Salisbury University - Biological Sciences: Seminars

Sabbatical Presentation Frogs, Bats, ... Salisbury University - MS Thesis Defense: ... Seminars are held on Thursdays at 4:00 pm in Henson 243.
Read more

Master’s Program Information Technology Project Management ...

Master’s Program Information ... •3 terms lectures and 1 term Master thesis I: ... New Bulgarian University, Sofia, Bulgaria, PSP Instructor, ...
Read more