Plegamiento Protéico y Estrés Conformacional en Células Microbianas Productoras de Proteínas Recombinantes: Revisión Comparativa de Huéspedes (revisión)

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Published on March 11, 2014

Author: manuelgug

Source: slideshare.net

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Revisión de artículo "Plegamiento Protéico y Estrés Conformacional en Células Microbianas Productoras de Proteínas Recombinantes: Revisión Comparativa de Huéspedes ("Protein Folding and Conformational Stress in Microbial Cells Producing Recombinant Proteins: A Host Comparative Review"), de Brigitte Gasser, et. al.

Manuel García Ulloa Gámiz

Problema • La producción de proteínas recombinantes in vivo es un proceso innatural para la célula huésped. – Síntesis de una proteína extraña. – Cantidades inusualmente altas de producción (sesgo metabólico = cuello de botella). • Resultados indeseables: – Proteínas mal plegadas / desplegadas = estrés conformacional = baja de rendimientos / muerte celular.

Estrés conformacional • Respuesta celular ante la acumulación de proteínas mal plegadas /desplegadas.

Plegamiento en Eucariotas • Lugar : Retículo Endoplásmico. • Proteínas involucradas: – Asistentes de plegamiento: • Calnexina. • HSP (heat shock proteins). • BiP. – Formación de puentes disulfuro: • PDI (protein disulfide isomerases). • Ero1. – Control de calidad de glicoproteínas: • UGT (UDP-glucose:glycoprotein glucosyltransferase). – Respuesta genética: • Ire1. • Hac1/hacA.

proteínas glicoproteínas Unfolded Protein Response ER Associated Protein Degradation (ubiquitinación + proteasoma) UGT Sec61 translocon

Respuestas ante estrés conformacional. 1.- UPR (unfolded protein response). 2.- Atenuación traducional (mediada por eIF2alfa). 3.- RESS (repression under secretion stress).

Influencias Ambientales en Plegamiento de Proteínas

Temperatura • Expresión genética (proteínas de membrana de ER, HSP, etc.), metabolismo. • *Bajar la temperatura de cultivo (en general) = aumento de productividad. – Pichia pastoris expresando Fab humano: 1.4x. • Hipótesis propuesta: menor temperatura = menor estrés conformacional = mayor cantidad de producto bien plegado. – Además, (en levaduras) a mayor temperatura, más rigidez en la pared celular, haciendo la secreción más difícil. • Deben tomarse en cuenta peculiaridades de organismo y proteína.

Oxigenación • Condiciones oxidantes = estrés oxidativo: – Acumulación de proteínas desplegadas. • Procesos de plegamiento oxidativos (formación de puendes disulfuro). • *Bajar el suministro de oxígeno. – Secreción de proteína heteróloga en P. pastoris aumenta 2x en condiciones hipóxicas. • *Adición de antioxidantes. – Mitiga el estrés oxidativo en P. pastoris cultivada en metanol.

Osmolaridad • No hay conexión clara con estrés conformacional. – Hiperosmosis: • Arresto temporal de ciclo celular en Saccharomyces cerevisiae. • Aumento de producción en células de mamífero. • Efectos positivos en P. pastoris al expresar fracción variable de cadena sencilla de anticuerpos. • Efectos negativos en P. pastoris al intentar secretar fracción Fc de anticuerpo.

pH • Depende de la proteína y la cepa utilizada. • En general, pH bajo en cultivo produce crecimiento lento y refuerza la pared celular (problema si la proteína es secretada).

Efectos del Estrés Conformacional en el Procesamiento de Proteínas

• BiP y PDI libres disminuyen cuando se sobreexpresan proteínas heterólogas en S. cerevisiae. • BiP aumenta al expresar scFv en S. cerevisiae y tripsinógeno humano en P. pastoris. • Sobreexpresión de componentes ERAD en P. pastoris. • Activación de UPR y ERAD por expresión de: – Activador del plasminógeno en T. reesei. y A. niger. – Quimosina bovina en A. nidulans. – Fragmentos de Fab y lipasa de Rhizopus oryzae en P. pastoris.

Búsqueda de mitigación de estrés conformacional Proteínas sobreexpresadas BiP Pdi Ero1 Hac1 Aumenta producción en S. cerevisiae. 10x más factor de crecimiento humano en S. cerevisiae. Aumento de rendimiento en la producción de HSA en K. lactis. 2.4x más secreción de alfa-amilasa de Bacillus y 2x de invertasa en S. cerevisiae. Disminuye producción en Hansenula polymorpha al expresar glucosa oxidasa de A. niger . 30-60% más lisozima humana en S. cerevisiae. No afecta la secreción de EGI de T. reesei en S. cerevisiae. Disminuye secreción de B-glucosidasa de Pyrococcus furiosus en S. cerevisiae. Aumenta secreción de B-glucosidasa de Pyrococcus furiosus en S. cerevisiae Aumento de expresión de Fab en S. cerevisiae. *Mejores resultados al combinar con calnexina. Sin efecto en la expresión de interferón gamma en H. polymorpha.

Estrés Conformacional en Procariotas

• Maquinaria de plegamiento ineficiente = baja calidad de proteína heteróloga = mayor estrés. • Respuesta a estrés conformacional: – Sobrerregulación de HSP, proteasas, chaperonas y otras cuya función es desconocida. – Formación de cuerpos de inclusión*.

*Cuerpos de Inclusión Desventajas: fracción insoluble = requiere tratamiento potencialmente destructivo para la proteína durante la purificación. Ventajas: grado de pureza mayor. Citoplásmicos Periplásmicos

Favarecimiento de cuerpos de inclusión con GFP • DnaK: chaperona bacteriana. – Aumenta solubilidad; perjudica el estado conformacional de proteínas agregadas (posible promoción de proteólisis). – DnaK- = menor solubilidad; mayor calidad conformacional y rendimiento. • **Solubiliad y calidad conformacional son 2 propiedades divergentes.

Tratamiento de proteínas contenidas en CI • Replegamiento in vitro bajo condiciones redox apropiadas. • Manipulación de condiciones in vivo, convirtiendo al citoplasma en un ambiente oxidante. • Secreción de proteína a periplasma (menos reductor que citoplasma).

Modelos de expresión procariotas no convencionales • Bacillus subtilis. – Alta capacidad de secreción. – Producción masiva = “Respuesta de Estrés por Proteínas de Secreción” = proteólisis de productos aberrantes. • Pseudoalteromonas haloplanktis. – Crecimiento acelerado incluso en altas densidades celulares. – Transformación sencilla. – Eficiente a bajas temperaturas (hasta 4ºC) = menor estrés conformacional: • Alpha-glucosidasa de levadura. • Factor de crecimiento nervioso humano. • Lipasas.

Conclusiones • Es necesario conocer y tomar en cuenta las necesidades fisiológicas de la célula para una producción mayor y de mejor calidad. • No ha sido posible crear el ambiente óptimo para el plegamiento de proteínas. Expresión de proteínas heterólogas in vivo. Alteraciones mayores en la fisiología de la célula huésped (estrés). Intentos por reestablecer la homeóstasis.

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