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Guía 4 tinción de microorganismos

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Information about Guía 4 tinción de microorganismos
Education

Published on February 24, 2014

Author: marcianita624

Source: slideshare.net

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FUNDACION UNIVERSITARIA DE POPAYAN LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS PRACTICA # 4 Guía No. 4 Página 1 Versión 1.1 PRACTICA # 4 TINCION DE MICROORGANISMOS 1. INTRODUCCIÓN Dado que los microorganismos son invisibles al ojo humano debido a sus tamaños celulares y el alto contenido del agua, los biólogos han desarrollado métodos de tinción de las células para facilitar su observación al microscopio. Existen una gran cantidad de colorantes aplicados en la microbiología, así como diversas técnicas de tinción, dependiendo del tipo de microorganismo que desea ser estudiados y los propósitos particulares de cada estudio. Esta práctica pretende introducir al estudiante a las técnicas y colorantes frecuentemente empleadas en la microbiología básica. Para observar las características de las bacterias en el microscopio es necesario hacer preparaciones (extendidos o frotis) sobre una lámina portaobjetos, que posteriormente deben ser teñidas para poder observarlas al microscopio. 2. OBJETIVOS  Aprender las técnicas del montaje de placas con bacterias y empezar a familiarizarse con el manejo de los cultivos. 3. CONSULTAS PRELIMINARES El estudiante deberá consultar sobre los colorantes empleados frecuentemente en biología y microbiología: naturaleza, clasificación, restricciones, riesgos y disposición de este tipo de compuestos. 4. MATERIALES Y REACTIVOS 4.1 Material que debe llevar cada estudiante  Tapabocas  Jabón antibacterial  tinta china 4.2 Material suministrado por el laboratorio  Laminas portaobjetos  Toallas de papel  Asa bacteriológica  Bandeja de coloración  Mechero  Cultivos bacterianos  Goteros 4.3 Reactivos Azul de metileno Decolorante alcohol – acetona

FUNDACION UNIVERSITARIA DE POPAYAN LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS PRACTICA # 4 Cristal violeta Fucsina Lugol de Gram Guía No. 4 Página 2 Versión 1.1 Verde malaquita 5% Safranina 0,5% Tinta china (nigrosina) Aceite de inmersión 5. PROCEDIMIENTO 5.1 PREPARACIÓN DEL EXTENDIDO O FROTIS BACTERIANO 5.1.2. A partir de medios sólidos (agares)        Coloque con el asa una gota de agua en el centro del círculo del portaobjetos. Esterilice el asa y enfríela introduciéndola en el borde del medio de cultivo Con el asa saque una pequeña porción de colonia bacteriana evite siempre tomar medio de cultivo. Coloque la muestra sobre la gota de agua del portaobjetos, haga una extensión delgada. Si usted observa que la suspensión no se extiende en la superficie del porta objetos, sino que se recoge en gotas, significa que el porta objetos está engrasado y deberá repetir el proceso en un porta objetos completamente limpio. Deje que el extendido se seque al aire Fije el extendido, esto es, páselo varias veces a través de la llama del mechero. Realice extendidos con todos los cultivos de bacterias que se entregaron. 5.2 COLORACIONES SIMPLES El estudio microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes, ya que en condiciones naturales son difíciles de observar. Los colorantes, que pueden ser ácidos, básicos y neutros, son compuestos orgánicos que contienen radicales cromóforos, es decir que producen color. La coloración simple es un método que consiste en teñir utilizando un solo colorante bien sea ácido o básico, como por ejemplo el azul de metileno, cristal violeta, safranina y la fucsina. Estos colorantes se emplean para apreciar la forma, la disposición y el tamaño pero, no muestran detalles de la estructura interna.    Coloque la lámina de la práctica anterior, en las que realizó los extendidos de leche, sobre la bandeja de coloración. Cubra totalmente el extendido con el colorante. Aplique a un extendido un solo colorante. Deje actuar los colorantes así: azul de metileno 5min., fucsina 30 seg. Transcurrido el tiempo necesario, lave las placas con agua, escurra y deje secar al ambiente.

FUNDACION UNIVERSITARIA DE POPAYAN LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS PRACTICA # 4   Guía No. 4 Página 3 Versión 1.1 Deje escurrir las placas sobre una toalla de papel Observe al microscopio. Haga esquemas de forma y distribución. 5.3 COLORACION DIFERENCIALES Las coloraciones diferenciales utilizan dos o más colorantes, que permiten contrastar o diferencias los organismos según el color que adquieren. Existe una gran variedad de técnicas de coloración, siendo las de Gram y Ziehl Neelsen las más empleadas en bacteriología. 5.3.1. TINCIÓN DE GRAM Fue elaborada por el Danés Hans Gram en 1884, y permite distinguir entre diferentes bacterias que puedan mostrar una morfología similar. Al examen microscópico de un extendido coloreado por el método de Gram que contenga una flora bacteriana mixta, aparecen las características diferenciales del método. Muchas bacterias conservan la combinación violeta-yodo y se teñirán de púrpura (Gram positivas), otras se colorean de rojo por la safranina o el colorante que se emplee en la contra-coloración (Gram-negativas). De esta manera, con este procedimiento no sólo se hace visible la forma, tamaño y otros detalles estructurales, sino que pueden agruparse los microorganismos presentes en tipos Gram-positivos y Gram-negativos, por sus reacciones frente a los colorantes. La diferencia en la reacción de coloración entre las positivas y las negativas se atribuye a la diferencia en su composición química. Las paredes de las células Gram-negativas tienen un contenido lipídico más elevado que las positivas, y aunque en ambas se forma un complejo cristal violeta-yodo, el alcohol extrae el lípido de las células Gram-negativas y aumenta por lo tanto la permeabilidad celular. Esto da como resultado la pérdida del complejo de colorantes y se colorean de rojo con la safranina o la fucsina. El mismo es retenido por las células Gram-positivas, en las cuales la deshidratación por el alcohol ocasiona una disminución de la permeabilidad, reteniendo el cristal violeta tras la decoloración y se observan de color violeta. Un microorganismo Gram-positivo puede presentar una pared sana, al sufrir daño en esta, se vuelve Gram-negativo; lo cual indica la importancia de la pared para la retención o escape del colorante. Las características de coloración de Gram pueden ser atípicas en cultivos muy jóvenes o muy viejos. Procedimiento:   Con el asa tomar una porción del cultivo bacteriano Hacer frotis, secar y fijar al calor

FUNDACION UNIVERSITARIA DE POPAYAN LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS PRACTICA # 4          Guía No. 4 Página 4 Versión 1.1 Teñir el frotis durante 1 minuto con cristal violeta Lavar con agua destilada Añadir la solución de yodo y dejar reposar durante 1 minuto Lavar con agua destilada Decolorar con acetona o una mezcla de partes iguales de acetona y alcohol. Por 10 segundos Lavar con agua destilada Hacer la coloración de contraste con safranina durante 1 minuto Lavar con agua destilada Secar y observar al microscopio, Cuadro 1. Resumen de los pasos a seguir en la coloración de Gram RESULTADOS PASO Colorante Básico Mordiente Decoloración Contraste TIEMPO GRAM + GRAM - Cristal Violeta 1 minuto Se tiñen deSe tiñen de violeta violeta Lugol 1 minuto Siguen Violeta Siguen Violeta Alcohol-Acetona 10 seg. Permanecen Se decoloran violeta Safranina 1 minuto Permanecen Se tiñen violeta rosado 5.4 TINCION NEGATIVA Consiste en mezclar bacterias en una pequeña cantidad de nigrosina o tinta china y extender la mezcla sobre la superficie de un portaobjetos. Esas dos sustancias no son colorantes realmente, debido a que no penetran al interior de la célula; por el contrario, crean un campo de contraste permitiendo que las bacterias transparentes se hagan visibles en un fondo oscuro. Esta técnica es útil para determinar morfología celular y tamaño. También es útil para ciertas bacterias, como espiroquetas que son difíciles de teñir. El procedimiento a seguir es:    Coloque en el extremo de un portaobjetos una gota de tinta china. Tome con el asa una muestra de cualquiera de las bacterias entregadas y mézclela suavemente con la gota. Utilizando un portaobjetos limpio, extienda la gota para que se forme una película delgada. Deje secar el extendido al aire. No aplique calor. Observe.

FUNDACION UNIVERSITARIA DE POPAYAN LABORATORIO DE SISTEMATICA Y ECOLOGIA DE MICROORGANISMOS PRACTICA # 4 Guía No. 4 Página 5 Versión 1.1 6. RESULTADOS Anote sus observaciones en un cuadro como el que se indica a continuación: Resultados de las coloraciones. Microorganismo Técnica Colorantes Esquemas y Observaciones Desarrolle los siguientes interrogantes:        ¿Porque son más difíciles de colorear las esporas que las células vegetativas? ¿A qué se debe la coloración de células?. ¿Cómo actúa un colorante ácido? ¿.uno básico?. ¿Los frotis de bacterias capsuladas no se lavan con agua ni se calientan. ¿Por qué?. ¿Cómo puede incrementarse el contenido del material capsular?. ¿Cómo se correlaciona la presencia de cápsula con la virulencia de una bacteria patogénica?. Describa un método por el cual se puedan obtener muestras de pared celular para analizar composición química. Clasifique las siguientes bacterias como Gram positivas o Gram negativas. 7. BIBLIOGRAFIA MADIGAN M. T., MARTINKO J.M. y PARKER J. BROCK. microorganismos. Octava edición. Prentice Hall Iberia, Madrid, 1999. Adaptado por: Adriana Marcela Peña Quina Bióloga – Docente programa Ecología Biología de los Revisado por: Arnol Arias de Biólogo – Coordinador de laboratorio

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