Espectroscopía de Absorción UV-visivle, Espectroscopía de Fluorescencia, Dicroísmo Circular

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Published on March 18, 2014

Author: manuelgug

Source: slideshare.net

Espectroscopía de absorción UV - visible. Mariette Viladomat Jasso

¿Qué es? Método cualitativo/cuantitativo de medición que utiliza radiación electromagnética (de la región visible, UV e infrarroja del espectro  380-780nm). La radiación de esta región del espectro, absorbida por las moléculas, provoca transiciones electrónicas que pueden ser cuantificadas.

Espectro Electromagnético Transición Cuántica Vibraciones de las moléculas. Niveles de energía de los e- de valencia. Niveles de energía de los e- interiores. Rotaciones de las moléculas.

Color por Transmisión.

<Lámpara de deuterio> <Monocromador> -Prisma -Red de <Sist. Óptico> <Divisor> <Blanco> <Disolución problema>

Ley de Beer-Lambert: Transmitancia: T = I / Io Absorbancia: A = ε bc ε – coeficiente de absortividad molar del medio b – distancia óptica o camino óptico (lo ideal es hacer una constante, usando cubetas de un tamaño estándar) c – concentración molar I - intensidad producto Io – intensidad inicial

Resultado Cualitativo.- Estructuras Químicas Cuantitativo.- Concentración (curva estándar) • Mayor concentración / Mayor camino óptico  Mayor absorción • Estructuras químicas específicas  λ absorbida (Dobles enlaces, luz visible) β-carotenos

Espectroscopía de Fluorescencia y Dicroísmo Circular Manuel García Ulloa Gámiz

Espectroscopía de Fluorescencia

Principio Físico. Luz UV Luz visible

Moléculas que emiten fluorescencia al exponerse a la luz UV • Aminoácidos aromáticos: – Triptofano (abs: 280 nm, emisión: 300 to 350 nm dependiendo de la polaridad del medio ambiente). – Fenilalanina. – Tirosina. • GFP. • Fluoróforos.

Mecanismo. *El detector puede ser: •PMT (Photomutiplier). •Photodiode. •CCD (Charge-Coupled Device). *Los filtros varían dependiendo de la longitud de onda que se quiera obtener. 90º monocromadores UV Se utilizan recipientes de cuarzo para dejar pasar la fulorescencia. + +

Aplicaciones en Biología Molecular • Determinación de la presencia de compuestos orgánicos: casi siempre a través de los aa’s aromáticos. • Conocer concentración de determinado compuesto en una muestra: intensidad de fluorescencia emitida. • Determinar estructuras secundarias en proteínas: uso de aa’s aromáticos cuya fuorescencia varía dependiendo de su entorno molecular (si está en una zona hidrofóbica, hidrofílica, si es parte de una alfa-hélice, etc.) = quenching.

Dicroísmo Circular

Principio Físico (luz linealmente polarizada) 1.- 3.- 2.-

Luz polarizada

Principio Físico (luz circularmente polarizada) 1.- 2.- 3.-

(A) Se representan los vectores de los componentes del haz antes de llegar a la muestra. (B) Esos mismos vectores después de interactuar con los solutos de la muestra, fuera de fase. (C) Los mismos vectores cuando son absortos en forma diferencial. Dicroísmo circular: rotación del plano lumínico debido a la diferente absorción de los componentes circularmente polarizados por una muestra dada.

90º Mecanismo La luz pasa por un filtro del cual únicamente sale la que se encuentra orientada en determinada dirección. Ésta es circularizada y choca con la muestra. Los datos son arrojados al final mediante el análisis de la luz saliente (pasa de circular a elíptica). UV

Aplicaciones en Biología Molecular • Determinación de estructuras secundarias y terciarias en proteínas: estructuras como la alfa hélice, la beta plegada y los giros, imparten determinado dicroísmo circular al péptido, haciéndolas reconocibles. *Se usan aa’s aromáticos debido a que su CD varía dependiendo de su entorno aminoacídico. • Determinación de orientación estructural en moléculas: dependiendo de la forma de luz colectada al final, la orientación (levógira o dextrógira) de una molécula.

• Estimar % de estructura secundaria: fracción de la proteína como α-hélice, β plegada, giro u otra. • Comprobar su hubieron cambios en estructura secundaria: al exponer a alta temperatura o agentes desnaturalizantes, por ejemplo. • Verificar si la proteína está en su conformación nativa: para comprobar efectos del pH, sales, solventes, temperatura, etc.

Bibliografía • Espectroscopía de fluorescencia: – http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_spectroscopy – http://www.oswego.edu/~kadima/CHE425/CHE425L/FLUORES CENCE_SPECTROSCOPY_08.pdf – http://www.chimica.unipd.it/camilla.ferrante/pubblica/files/Electro nicEmission2011.pdf • Dicroísmo Circular – http://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism – http://www.mscwu.wur.nl/NR/rdonlyres/256B4909-D151-45EF- BA90-47A81D1F17A0/57402/Kelly2005.pdf – http://web.usal.es/~jmcsil/biblioteca/biofisica/unizar/CDIRl.pdf – http://docencia.izt.uam.mx/docencia/alva/Dicroismo.htm

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