Eletroforese de hemoglobina em pH alcalino

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Published on April 24, 2014

Author: estherfrois

Source: slideshare.net

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Resumo do método de eletroforese de hemoglobina em pH alcalino e interpretação.

ELETROFORESE DE HEMOGLOBINA EM pH ALCALINO INTRODUÇÃO  A eletroforese serve para dividir as partículas de uma mistura de acordo com sua "eletricidade" e massa.  A eletroforese em pH alcalino da um resultado diferente do que a em pH ácido pq modifica a carga da hemoglobina.  A hemoglobina (Hb) das hemaceas é dividida em varios tipos: o 95 a 98% de Hb A1 (2 cadeias alfa + 2 cadeias beta + grupo heme) o 2 a 3% de Hb A2 (2 cadeias alfa + 2 cadeias delta + grupo heme) o 0 a 2% (quase nada) de Hb Fetal (2 cadeias alfa + 2 cadeias gama + grupo heme)  A Hb é negativa em PH alcalino e migra para o lado positivo.  “A análise das hemoglobinas constitui importante método diagnóstico para estudo das anemias hemolíticas e talassemias. A principal hemoglobina (Hb) dos adultos é a HbA, com pequenas quantidades de HbA2 e HbF. A Hemoglobina fetal (HbF) predomina, ao nascimento, com seus níveis, decrescendo até os 6 meses de idade.”  “A eletroforese permite a separação dos principais genótipos de hemoglobinas variantes e talassemias. A sua avaliação é qualitativa, podendo em algumas situações supor que determinada fração de hemoglobina esteja elevada. A eletroforese de hemoglobina em pH alcalino quando realizado em acetato de celulose permite a visualização da Hb H que está presente e pessoas portadoras de talassemia alfa. Para identificar a Hb H são necessários alguns procedimentos:  usar amostra de sangue hemolisada com saponina a 1%.  aplicar excessiva quantidade de hemolisado.  avaliar visualmente a presença da fração de Hb H entre 5 a 10 minutos do início da corrida eletroforética.  ao comprovar a presença de Hb H, anote a ficha do paciente, pois com o passar do tempo o processo termodinâmico da eletroforese desnatura a Hb H.”  Função do tampão:

PROCEDIMENTO  É extraído a Hemoglobina das hemaceas do sangue: a) Centrifuga o sangue b) Despreza o plasma c) Lava o sedimento (o que ficou no fundo do tubo Falcon) 3 vezes com solução salina d) Despreza o sobrenadante (que ficou por cima) e) Adicionar um volume igual ao do sedimento de água destilada f) Homogeneizar g) Adicionar um volume de clorofórmio igual ao da solução sedimento+ água destilada h) Agitar vigorozamente i) Centrifugar j) Retirar o sobrenadante (hemolizado) e ajustar a concentração para 4,0 g/Dl  Uma fita de celulose é aclopada na cuba de eletroforese co as pontas mergulhadas num tampão Tris- EDTA-Borato  Para ter um padrão no perfil eletroforetico (resultado da eletroforese), usa-se um tipo de fita de plástico para aplicar a amostra (mergulha a fita na amostra, e toca a fita, sujando ela)  Aplica- se em cada fita, um do lado da outra de forma e quantidade iguais: 1 padrão e as amostras.  Realiza a eletroforese  Mergulha a fita em acido acético, para clarear ela a ponto de só dar pra ver as bandas  Realiza a leitura

LEITURA  Em situação normal, o perfil eletroforético (da hemoglobina de um individuo normal) é assim: Sendo que, OLHANDO DE BAIXO PARA CIMA: 1° banda= ponto de aplicação da amostra 2° banda= anidrase carbônica (alguma coisa q eu não sei o q é, mas não tem importância pra gente, só ta lá) 3° banda= Hb A2 4° banda= ATÉ 6 MESES DE IDADE: Hb fetal APÓS 6 MESES DE IDADE: Hb A1 (geralmente não tem Hb fetal) 5° banda (só para bebes com até 6 meses)= Hb A1  As hemoglobinas podem ser mutantes, quando tem alteração nas cadeias protéicas- talassemias-, virando Hb C, Hb E, Hb O... A forma que elas assumem no perfil eletroforético é:

Sendo que, OLHANDO DE BAIXO PARA CIMA, o perfil das HBs mutantes: 1. Ponto de aplicação da amostra 2. Anidrase carbônica 3. Hb C, E ou O, qndo tem muita quantidade. Obs: a Hb A2 tbm está nessa faixa, mas o limite dela é 10%, ela não tem quantidade maior que essa, ficando sempre uma camada fininha, mesmo quando está no limite. 4. (Entre a Hb A2 e Hb A: ) Hb S,D, G e Lepore 5. Hb K 6. Hb J e Bart’s 7. Hb I e N 8. Hb H  Transparentização é o processo pra fita ficar transparente, igual plástico, só com a marca da hemoglobina Ex:  Hemoglobinopatia S: Anemia falciforme: hemacea falciforme: drepanócito: presença de Hb S O paciente apresenta a partir do primeiro ano de idade, anemia de intensidade significativa, icterícia que pode ser confundida com hepatite, dores ósseas e articulares que podem simular reumatismo, crises de dores abdominais, às vezes tão intensas, que confundem com a apendicite e também quadro pulmonares, similares aa broncopneumonia. Os sintomas costumam aparecer em crises agudas relacionadas à

presença de infecções, esforço físico excessivo, desidratação, etc. Pode ocorrer também hematúria (sangue na urina) provocada pela Hemoglobina S. Estes pacientes apresentam algumas restrições para atividade física, e devem sempre procurar orientação médica. Com estes cuidados, podem ter na maioria das vezes vida quase normal, inclusive em relação ao trabalho desde que não exerçam atividades físicas intensas.  Hemoglobinopatia AS: anemia hemolítica branda: hemacea normal: presença de Hb S e Hb A  Hemoglobinopatia C: anemia hemolítica: hemacea em formato de alvo (codócito) e microesferocitos e esplenomegalia: presença de Hb C Neste tipo de hemoglobinopatia, o paciente pode não ter manifestações clínicas ou apresentar somente uma anemia leve a moderada e aumento do baço. É totalmente compatível com vida normal, não sendo necessário nenhum tratamento ou limitação de atividades.  Mais informações no link: <http://www.biolider.com.br/media/images/00001856_ELETROFORESE%20DE%20HEMOGLOBIN A.pdf > < http://www.ff.ul.pt/~jvitor/My_site/GH_LCS_files/Protocolo1.pdf >

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