cocos gram positivos

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Published on February 26, 2014

Author: Albamarina7

Source: slideshare.net

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Cocos Gram Positivos.

COCOS GRAM POSITIVOS CGP

Identificación de Cocos Gram Positivos de Importancia Clínica

COCOS GRAM POSITIVOS Catalasa Positiva Staphylococcus Sp Catalasa Negativa Streptococcus Enterococcus

STAPHYLOCOCCUS Sp COAGULASA DNASA + - S. Aureus S.C.N Novobiocina 5 ug Resistente S. Saprophyticus Sensible S. Epidermides

STREPTOCOCCUS HEMOLISIS Beta Hemólisis Bacitracina Sensible S. pyogenes Resistente P. CAMP Positiva S. agalactiae Alfa Hemólisis P. Optoquina Positiva Negativo S. pneumoniae No Hemólisis Bilis esculina crecimiento NaCl 6.5% PYR Positivo Enterococcus Spp Negativo Streptococcus grupo viridans

PRUEBAS DE IDENTIFICACION

PRUEBA DE CATALASA Enzima que descompone el peroxido de hidrogeno en oxigeno y agua. H2 O 2 H2O + O2 (Burbuja de gas) Catalasa Técnica: Colocar una gota de H2O2 en un porta objeto y añadir con asa una colonia de la bacteria en estudio. “Nota” La tecnica no se puede hacer con colonia aislada de Agar Sangre ya que pueden dar falsos positivos porque los eritrocitos tienen actividad de catalasa. Resultados: POSITIVO: Formación de burbujas (desprendimiento de O2) NEGATIVO: No formación de burbujas.

PRODUCCION DE COAGULASA Enzima que transforma el fibrinogeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo visible. Técnica: Hacer una suspensión en plasma con colonias de Staphylococcus en un tubo estéril. Incubar a 35ºc de 2 a 24h Resultados: PRUEBA POSITIVA: Formación de Coagulo PRUEBA NEGATIVA: No formación de coagulo

PRODUCCION DE LA DNASA (Desoxirribonucleasa) Enzima que desdobla al ácido desoxirribonucleico en sus nucleótidos. Técnica: Sembrar una estría en la placa de Agar DNASA. Incubar a 35ºc x 24h Revelar agregando a la placa HCL al 10%. Resultados: REACCION POSITIVA: Formación de un halo transparente alrededor de la estría. REACCION NEGATIVA: No formación de halo.

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA NOVOBIOCINA Es un ATB que inhibe el crecimiento de Staphylococcus epidermides. Técnica: Efectuar una siembra masiva en Agar Mueller Hinton colocar el disco de Novobiocina de 5 ug. Incubar 35ºC x 24h. Resultados: SENSIBLE: RESISTENTE: ≥ 16 <16

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA OPTOQUINA La Optoquina inhibe selectivamente al desarrollo del Streptococcus Pneumoniae. Técnica: Hacer un inoculo equivalente al tubo 0.5 de la escala de MC. Farland Hisopar el inoculo en Agar MH sangre al 5% colocar el disco de optoquina Incubar a 35º C de 20 – 24h en lata con vela para proporcinar 5% de CO2 Resultados: SENSIBLE: Mayor 14 mm Halos entre 9 – 14 deben ser Confirmado con la prueba de Solubilidad en Bilis

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA BACITRACINA Es un ATB que inhibe el desarrollo del Estreptococos pyogenes a bajas concentraciones 0.02 a 0.04 unidades. Técnica: Hacer una siembra masiva en placa de Agar sangre, colocar el disco de Bacitracina. Incubar a 35ºC por 24h. Resultados: SENSIBLE: Cualquier halo de inhibición.

PRUEBA DE CAMP La actividad hemolítica de la beta lisina, Estafilococica sobre los eritrocitos se ven intensificados por un factor extracelular producido por el estreptococos del grupo B llamado factor Camp. Técnica: En una placa de Agar sangre realizar una estría de estreptococos en forma perpendicular a otra estría de Staphylococcus aureus, incubar a 35ºC x 24h. Resultados: CAMP POSITIVO: Formación de una flecha entre la estría del estreptococo y la estría de Staphylococcus aureus. CAMP NEGATIVO: No formación de flecha.

DESARROLLO EN NaCl al 6.5% Los Enterococcus tienen la capacidad de crecer a altas concentraciones de NaCl. Técnica: Hacer una suspensión en caldo NaCl al 6.5% con colonias de Enterococcus. Incubar a 35ºC x 24h Resultados: POSITIVO: Crecimiento en NaCl al 6.5% (Turbio) NEGATIVO: No crecimiento. (Transparente)

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA Se basa en la capacidad que tienen algunas bacterias de hidrolizar la Esculina en presencia de la bilis al 40% . Técnica: Sembrar con asa en punta en el medio B.E. Incubar a 35º C x 24h. Resultados: B.E POSITIVA: Ennegrecimiento del medio. B.E NEGATIVA: No ennegrecimiento del medio

Prueba de la Hidrólisis del PYR (Producción de Pirrolidonil-beta-Naftilamida Consiste en la capacidad de ciertas bacterias de hidrolizar la Pirrolidonil-beta naftilamida liberándose el grupo pirrolidico que se determina con el reactivo revelador. (N-N dimetilamino cinamaldehido). Técnica: Preparar una suspensión de la bacteria en estudio en solución fisiológica estéril se le agrega el disco impregnado con el reactivo se incuba 30 minutos a 35ºC, luego de la incubación se agregan 2 gotas del reactivo revelador. Resultados: POSITIVO: Disco color Rosado a Rojo NEGATIVO: Disco y/o solución color Amarillo a Incoloro.

QUE ENSAYAR Y QUE INFORMAR EN EL ATB DE COCOS GRAM POSITIVOS DE IMPORTANCIA CLINICA

Staphylococcus spp Informar Antibióticos Ensayar Orina Otros LCR A I Ampicilina 10 µg X X X Ampicilina/sulbactama 10/10 µg X X X X X X X X X X CXM X X X X Oxacilina 1µg X Cefoxitina 30 µg X Cefalotina 30 µg Gentamicina 10 µg X Eritromicina 15 µg X X Clindamicina 2 µg X X Rifampicina 5 µg X X X Trimetropina/sulfametoxazol 1,25/23,75 µg X X X Minociclina 30 µg X Vancomicina 30 µg X Ciprofloxacina 5 µg X Norfloxacina 10 µg Nitrofurantoinas 300 µg X X X X X X X X X X X X X X La resistencia del Staphylococcus a la oxacilina predice igual resistencia a todos los ATB Beta-lactamicos, incluyendo cefalosporina de primera, segunda, tercera y cuarta generación, inhibidores de beta-lactamasas y carbapenemes. Frente al aislamiento de staphylococcus multi-resistente deberá ensayarse: Linezolid, Quinupristina/Dalfopristina y nuevas fluorquinolonas. X

Enterococcus spp Antibióticos Informar Ensayar Orina Otros Sitios X Ampicilina (10 µg) X X Gentamicina (120 µg) X X Estreptomicina (300 µg) X X Vancomicina (30 µg) X X Teicoplanina ( 30 µg) X Ciprofloxacina (5 µg) X X Nitrofurantoina (300 µg) X X En los enterococos, la sensibilidad a ampicilina predice sensibilidad a las penicilina asociadas a los inhibidores de beta-lactamasa (ampicilina/sulbactama, amoxicilina/Clavulánico y peperacilina /tazobactama). Frente al aislamiento de Enterococcus vancomicino-resistente deberá ensayarse: Tetraciclina, Cloranfenicol, Rifampicina, Linezolid, Quinupristina/dalfopristina y nuevas Fluorquinolonas. Los discos de alta carga (Gentamicina 120 µg y estreptomicina 300 µg) se utilizan para predecir sinergia entre Penicilina, ampicilina o Vancomicina y un aminoglucósido.

Streptococcus pyogenes (grupo A) Antibióticos Ensayar Informar Fauces Eritromicina X X Clindamicina X Otras Localizaciones X X En Streptococcus pyogenes el CLSI no recomienda ensayar penicilina ni ningún otro antibiótico betaLactamico, ni Vancomicina, ya que no se encontraron, hasta la presente cepas resistente. La resistencia a eritromicina predice resistencia a roxitromicina, Claritromicina y azitromicina. En pacientes con fascitis necrotizante se debe informar clindamicina a demás de penicilina , ya que en estas situaciones deben utilizarse ambos antibióticos simultáneamente, dado que en esta infección los microorganismos se presentan en un alto inóculo y en fase estacionaria.

Streptococcus pneumoniae Antibiótico Ensayar Informar Meningitis Neumonía Otitis PEN, CRO/CTX (CIM) PEN (CIM) AMX/PEN (CIM) Oxacilina 1 ųg X Eritromicina 15 ųg X X X Clindamicina 2 ųg X X X Trimetoprima/sulfametoxazol 1.25/23.75 ųg X X X Tetraciclina 30 ųg X X Rifampicina 5 ųg X X Vancomicina 30 ųg X X Oxacilina es el único antibiótico beta-lactámico que se debe ensayar en la prueba de sensibilidad por el método de difusión en Agar. Frente al aislamiento de cepas resistente a Oxacilina (halo ≤ 19) se debe realizar CIM a Penicilina para determinar el nivel de resistencia. • La sensibilidad a Oxacilina predice sensibilidad a: penicilina, ampicilina, amoxicilina, cefotaxima, ceftriaxona, cefepima, Cefixima, cefuroxima, imipemen y meropenem.

PROBLEMAS PLANTEADOS POR LOS COCOS GRAM POSITIVOS La resistencia bacteriana a los ATB esta relacionada: A la calidad de las practicas higiénicas hospitalarias (Staphylococos meticilino-resistente). Al uso intensivo de ciertos ATB (Enterococos glucopeptido resistente). Al hacinamiento de pacientes (Neumococo con sensibilidad disminuida a penicilina).

STAPHYLOCOCCUS METILICINA RESISTENTE Los SMR presentan en su membrana una PBP adicional (PBP 2a) Gen mecA. De Baja afinidad a los ATB beta-lactamico Los SMR requieren mayor cantidad de cualquier ATB betalactamico para saturar las PBP. Por ello son resistente a todos los beta lactamicos incluido los carbapenemes.

Staphylococcus aureus Meticilina Resistente (MRSA) Incidencia incrementando en hospitales especialmente en UCI o en pacientes con quimioterapia Están comenzando a aparecer cepas Vancomicina Intermedia y Resistente Esta Emergiendo MRSA adquirido en la comunidad (CA-MRSA) que aparece susceptible a muchos agentes orales

Staphylococcus aureus Meticilino Resistente Adquirido en la Comunidad CA-MRSA

Propiedades Distintivas CA-MRSA Resistente solamente a Meticilina con Resistencia cruzada solamente a otros ß-lactamicos Asoc. con Síndromes semejando a los causados por MSSA Puede causar Infecciones Serias (fatales)

Manifestaciones CA-MRSA Neumonía Necrotizante Osteomielitis Abscesos Empiema Fascitis Necrotizante Tromboflebitis Séptica Sepsis Severa

CA-MRSA Opciones de Tratamiento Clindamicina - Oral es el agente que se ha redescubierto para Infecciones por CA-MRSA CA-MRSA la prueba es usualmente susceptible a Clindamicina El problema es cuando el microorganismos tiene una prueba de susceptibilidad: Eritromicina-R y Clindamicina-S Algunas cepas pueden tener Resistencia Inducible

DETECCION DE OXACILINA RESISTENTE EN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Método: Oxacillin Screening Agar Agar Mueller Hinton con 4% de NaCl y 6µg/ml de Oxacilina. Suspension bacteriana 0.5 McFarland Sembrar sobre el agar 10 µl de la suspensión. Incubar 24h a 35º C. Crecimiento > 1 Colonia es positivo para Staphylococcus resistente a Oxacilina. La resistencia a la Oxacilina indica resistencia a todos los ATB ß Lactamicos y ß-lactamicos asociados a los inhibidores de ß lactamasas independientemente de su sensibilidad “In Vitro”

Punto de Corte establecido por el CLSI para Oxicilina DD (mm): R I ≤ 10 ≤ 17 S.aureus CoNS S 11-12 - ≥13 ≥18 MIC (µg/ml): S S.aureus CoNS ≤2 I - ≤ 0.25 R ≥4 - ≥0.5

Screen – Difusion de Disco para Resistencia mediada por gen mecA en Staphylococcus Reemplazar disco de Oxacilina por disco de Cefoxitina. Realizar método Estándar de Difusión de Disco con Disco de Cefoxitina (30 ųg). Incubar por 24 h. Los resultados pueden ser reportados despues de 18 h, si son resistentes. Reportar el resultado para OXACILINA, no para Cefoxitina.

Staphylococcus spp. “Los resultados de la prueba de Difusion de Disco con Cefoxitina de 30 µg debe ser usados para predecir la Resistencia mediada por gen mecA en Staphylococcus”.

Punto de Corte establecido por el CLSI para Cefoxitina (30µg) Cefoxitina Zona (mm) S.Aureus R ≤ 21 S ≥ 22 CoNS ≤ 24 ≥ 25

Staphylococcus spp. Eritromicina / Clindamicina Mecanismo Eflujo Alteración Ribosomal inducible Alteración Ribosomal constitutiva GEN Eritro Clinda msrA R S erm R S* erm R R

“Test D” – Reacción Positiva Resistencia Inducible a Clindamicina (mediada-erm) Antibiograma por Difusión de Disco: Colocar discos de 2 µg Clindamicina y 15 µg Eritromicina a una distancia de borde a borde de 15 mm a 26 mm. 15 - 26 mm

“Test D” – Reacción Negativa NO hay Inducción (Resistencia a Eritromicina: Mediada por gen msrA)

Staphylococcus Aureus con sensibilidad Intermedia y Resistencia a Vancomicina Un Problema - Crítico • • Vancomicina sigue siendo una droga importante por no sólo tratar Infecciones por Staphylococcus aureus, Staphylococcus Coagulasa-negativa, Neumococos, y una variedad de otros organismos Gram Positivos. Es muy importante descubrir la Resistencia Emergente a Vancomicina.

VISA Fenotipo vs. VRSA Genotipo Las cepas VISA representan un fenotipo que probablemente resulta de mutaciones en varias vías genéticas, que bajo larga presión con Vancomicina produce: - Paredes celulares alteradas, - Cambios en las vías metabólicas, - Lento crecimiento. En las cepas VRSA hay un cambio en el genotipo donde las cepas adquieren el gen de resistencia vanA, muestra una pequeña perdida de amplitud, y pueden transferir la resistencia de Vancomicina a otros organismos

Criterios de Interpretación de la CLSI Vancomicina y Staphylococcus spp. Vancomicina Disco (30 µg) MIC (µg/ml) Sensible Intermedio Resistente ≥ 15 mm ND ND ≤2 4-8 ≥ 16

Metodo de Screening para detectar mecanismo de Resistencia a Vancomicina Usar Placas de agar preparado comercialmente Preparar una suspensión con 4 a 5 colonias en caldo o solución salina a 0.5 McFarland, mezclar en vortex. Usar asa calibrada de 1 o 10-µl o pipeta para inocular en la placa (hasta 6 cepas/placa) Dejar que el inóculo se absorba.

Metodo de Screening para detectar mecanismos de Resistencia a Vancomicina Invertir las placas e incubar a 35ºC en ambiente aeróbico. Examinar después de 16-18 hrs. de incubación; si no hay crecimiento, re-incubar y examinar 24 horas después. Crecimiento >1 colonia es positivo para VISA/VRSA Confirmar identificación; no realizar MIC automatizado

Resistencia a Vancomicina – Enterococcus spp.  Fenotipos más comunes: Resistencia Adquirida Van A: Fenotipo de alto nivel de resistencia a Vancomicina y E. faecium Teicoplanina. Van B: Bajo a alto nivel de resistencia E. faecalis solo a Vancomicina. Resistencia Intrínseca Van C: Fenotipo asociado a bajo nivel de E.gallinarum resistencia a Vancomicina.

Criterios de Interpretación de la CLSI para Enterococcus spp. Agente antimicrobiano Resistente Menor o = Intermedio Sensible Mayor o = Vancomicina 30μg 14 15 – 16 17 Ampicilina 10μg 16 - 17 Gentamicina 120 μg 6 7-9 10 Estreptomicina 300 μg 6 7-9 10

Streptococcus pneumoniae con Sensibilidad disminuida a Penicilina La resistencia a la penicilina se debe a la alteración de los PBP (gen en mosaico) y no por la producción de beta – lactamasa.

Screen Difusión de Disco para detectar Resistencia a la penicilina en S.pneumoniae Realizar método Estándar de Difusión de Disco en Agar MH sangre al 5% con disco de Oxacilina (1µg). Incubar a 35º C de 20-24 h. En presencia de CO2 5% Reportar los resultados para Penicilina, no para Oxacilina. Punto de Corte: S ≥ 20 mm Halos < 19mm realizar CIM

RECORDEMOS Que Lavarse las manos y utilizar Correctamente los ATB reduce la resistencia bacteriana. Muchas Gracias !!! Robafi30@hotmail.com

AUTOEVALUACION Se reciben tres muestras de Hemocultivos: a las 48 hs son positivas, observándose en la coloración de Gram.: cocos Gram. (+) en racimos y cortas cadenas. ¿Qué medios de cultivo elegiría? EMB Agar Tripteína soya Agar sangre Agar chocolate Después de 24 hs de incubación a 35ºC, se observan colonias con iguales características y tinción de Gram. coincidente con la anterior. ¿Cuál de las siguientes pruebas realizaría primero? Dnasa Coagulasa Oxidasa Catalasa ¿De cual de los medios de cultivo anteriores se puede realizar? Se obtienen los siguientes resultados en las pruebas bioquímicas. Dnasa (-) Coagulasa (-) Resistencias a Novobiocina (-) Catalasa (+) De que microorganismos se trata? En este caso provienen de un paciente con catéter implantable sometido hace un año a transplante de medula ósea Informa: Positivo Se solicitan mas muestras Negativo Contaminado

Tipo de Muestra = Hueso Microorganismo = Staphylococcus epidermides. Eritromicina Oxacilina Vancomicina Clindamicina R 6mm R 6mm S 21mm R 6mm Gentamicina S Rifampicina R Trimeto/sulfametoxazol R 17mm 6mm 6mm ¿Cómo informaría cefalotina, con respecto al resultado de Oxacilina?.

Tipo de Muestra = Sangre Microorganismo = Staphylococcus aureus Ciprofloxacina Eritromicina Oxacilina Vancomicina R R R S 6mm 6mm 6mm 19mm Clindamicina Gentamicina Rifampicina Trimeto/sulfametoxazol R 6mm R 6mm S 34mm S 27mm ¿Qué método utilizaron para predecir la resistencia a Oxacilina?

Tipo de Muestra = Sangre Microorganismo = Streptococcus pneumoniae Cloramfenicol S 30mm Eritromicina Oxacilina Tetraciclina Vancomicina S 22mm S 23mm S 25mm Rifampicina S 30mm Trimeto/sulfametoxazol S 25mm ¿Se informaría Oxacilina? S 32mm

Tipo de Muestra = Ulcera Externa Microorganismo = Enterococcus faecalis Ampicilina Gentamici-Alta Carga S 36mm S 19mm Eritromicina S Vancomicina S 15mm 19mm ¿A que otros ATB es sensible este Enterococcus con relación al resultado de ampicilina?

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