Células madre, pasado y futuro

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Published on March 12, 2014

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Frente al avance que significa para la medicina el uso de las células madres como terapia regenerativa una puesta a punto que se imparte en la Cátedra de Bioética

1 CÉLULAS MADRE PASADO Y FUTURO JUSTO AZNAR DIRECTOR DEL INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA VIDA ABRIL 2008

2 CÉLULAS MADRE PASADO Y FUTURO

3 CÉLULAS MADRE. PASADO Y FUTURO PASADO FUTURO Cultivan por primera vez células madre embrionarias humanas Obtienen células similares a las embrionarias por reprogramación de células adultas. Nacen las células iPS Shinya Yamanaka 2006 James Thomson 1998 2007 Obtienen células iPS humanas

4 ¿QUE SON LAS CÉLULAS MADRE? Las células madre, también denominadas células troncales, estaminales o en inglés células stem, “son células que tienen la capacidad, no solamente de poder cultivarse y reproducirse a si mismas, sino también de poder producir células adultas de diferente progenie, es decir de diferentes tejidos” I.L. Weissman. New England Journal of Medicine 346; 1576-1583, 2002

5 TIPOS DE CÉLULAS MADRE Pueden ser: Totipotentes Pluripotentes Multipotentes Unipotentes Pueden dar lugar a Capaces de formar células de todos los linajes del organismo. En los mamíferos solamente lo son el cigoto y los primeros blastómeros Capaces de formar células de todos los linajes del cuerpo, son las denominadas células madre embrionarias. Son las células madre adultas capaces de formar distintos tipos de células de un mismo linaje, como las células madre hematopoyéticas Son células madre adultas que producen células de un solo linaje, como las células madre germinales, entre ellas las espermatogonias que generan el esperma Células Porsupotencialidad Células madre embrionarias Células madre de tejidos adultos Por su origen Textos de: R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567-582, 2008

6 CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Las células madre embrionarias son células derivadas de los embriones, no las células constituyentes de los embriones S. Holm. Journal of Medical Ethics 34; 63-64, 2008

7 // cigoto embriones de: 2 células 3 células 4 células ser humano adulto blastocisto DESARROLLO EMBRIONARIO

8 DESARROLLO EMBRIONARIO J. Rossant Cell 132, 527-531, 2008 CONSTITUCIÓN DE LA MASA CELULAR INTERNA

9 De embriones: • Sobrantes de fecundación in vitro • Obtenidos por transferencia nuclear somática (clonación) • Generados por partenogénesis a partir de ovocitos animales o humanos ¿DE DÓNDE SE OBTIENEN LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS?

10 ¿QUÉ NÚMERO DE EMBRIONES CONGELADOS HAY ACTUALMENTE? Aproximadamente: 1. En España .................... 200.000 2. En Estados Unidos ...... 400.000 3. En todo el mundo .......1.500.000 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMRIONARIAS DE SOBRANTES DE FECUNDACIÓN IN VITRO

11 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS A PARTIR DE BLASTOCISTOS GENERADOS POR TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA

12 TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA Ovocito Célula adulta Enucleación Enucleación ACTIVACIÓN TRANSFERENCIA NUCLEAR Cigoto híbrido Embrión de dos células Masa granulosa interna Resto embrionario Células madre embrionarias Embrión de 64 a 200 células (blastocisto)

13 PARA OBTENERLAS ES NECESARIO CLONAR UN ANIMAL O UN INDIVIDUO HUMANO OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS AUTÓLOGAS

14 CLONACIÓN ANIMAL RESUMEN HISTÓRICO Heidi Ledford. Nature 445; 800-802, 2007

15 Clonación de lobos Investigadores de la Universidad de Seúl publican en marzo de 2007 la clonación de dos lobos, Snuwolf y Snuwolffy M.K. Kim y col. Cloning and Stem Cells 9; 130-137, 2007 Nature / DOI: 10.1038 / News 070430- 4. 1 de mayo de 2007 ) Un equipo de la propia Universidad de Seúl confirma, el 27 de abril de 2007, que los lobos clonados son genuinos clones CLONACIÓN ANIMAL

16 • Se consigue por primera vez en el mundo clonar primates (macacus rhesus) • A partir de 304 ovocitos obtenidos de 14 hembras macacus rhesus • Se generaron 2 líneas de células madre embrionarias Eficiencia 0.7% J.A. Byrne y col. Nature 450; 497-502, 2007 CLONACIÓN ANIMAL Clonación de primates

17 1 No consiguieron obtener células madre de los blastocistos clonados 1. Cibelli JB. J Regener Med 2; 25, 20011 2. Chen Y. Cell Res 13; 251, 2003 3. Guangxin L. Chinose Sci Bull 48, 1240, 20031 4. Hwang WS et al. Science 303; 1669, 2004 5. Hwang WS et al. Science 308; 1777, 2005 6. Stojkovic M et al. Reprod Bio Med Online 11, 226, 20051 7. Zavos P. et al. Archives of Andrology 52; 243, 2006 INTENTOS DE CLONACIÓN HUMANA

18 ¿SE HA CONCEGUIDO LA CLONACIÓN HUMANA? No parece que hasta ese momento existiera evidencia de que se hubiera logrado la clonación de seres humanos J. Yu y col. Science 318; 1917-1920, 2006 J. Hanna y col. Science 318; 1920-1923, 2007 T. Kakahashi y col. Cell 131; 861-872, 2007 X Yang y col. Nature Genetics 39; 295-302, 2007

19 CLONACIÓN HUMANA Sin embargo, existen razones fundadas para creer que se van a poder producir clones humanos X Yang y col. Nature Genetics 39; 295-302, 2007

20 • Un equipo de la firma comercial Stemagen Corporation de la Jolla, California, publica un artículo en donde afirman que han podido obtener blastocistos humanos por transferencia nuclear somática utilizando células adultas de piel y ovocitos de mujeres jóvenes (20-24 años) sobrantes de fecundación in vitro • También han obtenido blastocistos a partir de un pequeño número de ovocitos humanos partenogenéticamente CLONACIÓN HUMANA AJ French. Stem Cells 26; 485-493, 2008

21 CLONACIÓN HUMANA • Aunque hasta el momento no hay evidencia de que se haya logrado obtener líneas celulares embrionarias a partir de embriones humanos • Existen razones fundadas para creer que se vana poder producir clones humanos X Yang y col. Nature Genetics 39; 295, 302, 2007

22 POTENCIAL TERAPÉUTICO DE LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS Se demuestra por primera vez que cardiomiocitos generados a partir de células madre embrionarias humanas pueden mejorar la función cardiaca de corazones de rata infartados M.A. Laflamme y col. Nature Biotechnology 25; 1015 – 1024, 2007

23 • A partir de células madre embrionarias obtienen células de músculo esquelético. • Cuando estas células se transfieren a ratones con distrófia muscular se mejora la función muscular sin que se produzcan teratomas • Estas experiencias sugieren la posibilidad de aplicarlas en pacientes con distrofia muscular, particularmente en la distrofia muscular de Duchenne EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS R Darabi y col. Nature Medicine 14; 134-143, 2008

24 APLICACIONES PRECLÍNICAS Se describe por primera vez la obtención de células similares a los fotoreceptores de la retina a partir de células madre embrionarias de ratón, mono e individuos humanos F Osaka y col Nature Biotechnology 26; 215-224, 2008

25 No se han aplicado clínicamente por la ineficiencia del proceso de clonación, por la falta de conocimiento de los mecanismos que lo sustentan, por la necesidad que existiría de mantener terapia inmunosupresiva durante toda la vida, por el riesgo de inducir el desarrollo de hematomas y por las dificultades éticas que su uso conlleva EXPECTATIVAS TERAPÉUTICAS UTILIZANDO CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

26 M. Enserink. Science 313; 160-163, 2006 “Nadie podría prometer hoy la falsedad de que con células madre embrionarias se puede curar a alguien inminentemente, esto es engañar cruelmente a pacientes y público” EXPECTATIVAS TERAPÉUTICAS UTILIZANDO CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

27 CÉLULAS MADRE DE TEJIDOS ADULTOS

28 ¿DE DONDE SE OBTIENEN LAS CÉLULAS MADRE DE TEJIDOS ADULTOS? De: • Diferentes tejidos adultos • Cordón umbilical • Placenta • Fetos abortados. A partir de células madre germinales • Teratocarcinomas o carcinomas embrionarios, especialmente de tumores testiculares

29 • Fusionándose con las células del órgano lesionado • Diferenciándose a células específicas de ese órgano • Favoreciendo la vasculogénesis a partir de células progenitoras endoteliales contenidas en el material celular o de células mononucleares de la médula ósea • Ejerciendo acciones paracrinas por liberación de factores de crecimiento, proteínas angiogénicas, factores tróficos o factores moduladores del sistema inmunológico • Remodelando físicamente la arquitectura tridimensional del órgano afectado MECANISMOS POR LOS CUALES EJERCEN SU FUNCIÓN LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS Estos mecanismos in vivo no parecen relevantes

30 EXPERIENCIAS CLÍNICAS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS

31 OBJETIVAS EXPECTATIVAS CLÍNICAS DERIVADAS DEL USO DE CÉLULAS MADRE DE TEJIDOS ADULTOS “Seguramente no hay un precedente así en la ciencia actual” J. Martin. The Lancet 365; 2070-2071, 2005

32 ENSAYOS CLÍNICOS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS APROBADOS POR LA FDA En enero de 2007 había ensayos clínicos aprobados por la Food and Drug Administration norteamericana. De ellos, más de 250 en infarto de miocardio, 24 en linfoma de tipo no-Hodgkin y 5 en tumores testiculares A. D. Prentice y G. Tarne Science 315; 328,2007 ENSAYOS CLÍNICOS REALIZADOS 1238

33 Updated 14/04/2007

34 ESTUDIOS EN INFARTO DE MIOCARDIO CON CÉLULAS MADRE ADULTAS

35 ENSAYOS CLÍNICOS PARA TRATAR EL INFARTO DE MIOCARDIO Hasta ahora en los ensayos clínicos promovidos para tratar el infarto de miocardio se han utilizado solamente células madre de médula ósea y células endoteliales progenitoras VFM Segers y RT Lee Nature 451; 937-942, 2008

36 APLICACIONES CLÍNICAS DE LAS CÉLULAS MADRE ADULTAS En un interesante artículo del pasado febrero se revisan los estudios realizados entre enero de 1997 y diciembre de 2007 sobre la utilización de las células madre de tejidos adultos con fines terapéuticos FUENTES: MEDLINE, EMBASE, Science Citatim Index, pagmes web FDA y de INS de Estados Unidos R.K. Burt y col. JAMA 299; 925-936, 2008

37 ENSAYOS CLÍNICOS CON CÉLULAS MADRE ADULTAS Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008

38 Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008 Clinical Trials of Stem Cell Therapy for Acute Myocardial Infarction With >=30 Patients

39 ENSAYOS CLÍNICOS EN INFARTO DE MIOCARDIO AGUDO VALORACIÓN GLOBAL • Se observa un modesto beneficio de la fracción de eyección ventrícular izquierda. En los interensayos es de 8’6 % y en los intraensayos del 2’4 % • No se producen efectos secundarios negativos Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008

40Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936, 2008 Clinical Trials of Stem Cell Therapy for Chronic Myocardial Ischemia and/or Heart Failure With >=20 Patients

41 ENSAYOS CLÍNICOS EN ENFERMEDAD ISQUÉMICA CORONARIA CRÓNICA VALORACIÓN GLOBAL • Aumento de la perfusión regional • Mejora de la contractibilidad cardiaca • Modesto aumento de la fracción de eyección ventricular izquierda • Reducción del dolor anginoso Burt, R. K. et al. JAMA;299,925-936,2008

42 ACCIONES FUTURAS EN RELACIÓN CON EL INFARTO DE MIOCARDIO • En la mayoría de los estudios el número de miocardiocitos que se generan y que se integran en el miocardio lesionado es demasiado pequeño para justificar la mejora de la función cardiaca observada • Esta mejora podría deberse a un efecto paracrino, por lo que la identificación de los factores que condicionan esta acción celular puede ser importante • Utilizar las células adecuadas en el lugar adecuado y desarrollar métodos más eficientes para generar el tipo celular deseado • Conocer mejor los mecanismos que regulan el metabolismo de los miocardiocitos • Conocer mejor los mecanismos del “homing” • Definir los factores presentes en el entorno celular lesionado que limitan la supervivencia y la integración funcional de las células transplantadas • Supresión del rechazo inmunológico para mejorar el efecto terapéutico VFM Segers y RT Lee Nature 451; 937-942, 2008 H.E. Fleming. Cell 132; 505-509, 2008

43 TERAPIA CELULAR • Terapia celular preparada de forma individual para cada paciente • Bancos universales de células madre • Utilización de fármacos que estimulen el aumento endógeno de células madre G.Q. Daley y D.T. Scadden. Cell 132; 544-548, 2008 OPCIONES FUTURAS

44 CREACIÓN DE ÓRGANOS BIOARTIFICIALES. INGENIERÍA DE ÓRGANOS POSIBLES ALTERNATIVAS AL TRANSPLANTE DE ÓRGANOS

45 PROBLEMAS FUNDAMENTALES DEL TRANSPLANTE DE ÓRGANOS • Limitación de órganos disponibles • Necesidad de inmunosupresión durante toda la vida

46 INGENIERÍA DE ÓRGANOS Depositando cardiomiocitos sobre delgadas láminas de material biocompatible se ha conseguido formar estructuras orgánicas de tres dimensiones A.W. Feinberg y col. Science 317; 1366-1370, 2007 CONSTRUCCIÓN DE ÓRGANOS SOBRE UNA MATRIZ ARTIFICIAL

47 PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL • El equipo de Doris A. Taylor, de la Universidad de Minessota ha conseguido por primera vez crear un corazón bioartificial HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008

48 PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL METÓDICA PARA OBTENERLO •Descelularización de corazones de cadáver de rata por perfusión con detergentes •Mantenimiento de la matriz extracelular, con conservación de una estructura espacial cardiaca acelular •Reperfusión con células cardiacas neonatales o células endoteliales aórticas de rata •Cultivo de estas estructuras recelularizadas en un medio similar al que se utiliza para el mantenimiento de órganos •Mantenimiento de la perfusión durante 28 días HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008

49 • A los 4 días de finalizar la reperfusión celular la estructura cardiaca generada se contrae • A los 8 días adquiere la función de la bomba cardiaca PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL RESULTADOS HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008

50 • La misma técnica de descelularización se ha utilizado con corazones de cerdo, de un tamaño similar al humano • También han conseguido descelularizar, pulmones, hígado, riñón y tejido muscular de diversos mamíferos PRODUCCIÓN DE UN CORAZÓN ARTIFICIAL PERSPECTIVAS FUTURAS HC Ott. Nature Medicine 14; 213-221, 2008

51 ALTERNATIVAS PARA LAALTERNATIVAS PARA LA OBTENCIÓNOBTENCIÓN DE CÉLULAS MADREDE CÉLULAS MADRE DE TIPO EMBRIONARIO.DE TIPO EMBRIONARIO. CONSIDERACIONES BIOLÓGICAS YCONSIDERACIONES BIOLÓGICAS Y ÉTICASÉTICAS

52 ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Para obtener células madre embrionarias hay que destruir al embrión del cual se obtienen, lo que indudablemente supone un importante problema ético. Por ello, hace unos años se planteó el reto de obtener células madre similares a las de los embriones humanos por procedimientos que no requirieran la destrucción de embriones Best Practical Research Clinical Obstetrics and Gynecology 18; 929-940, 2004

53 ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Esta inquietud fue recogida por el Consejo Asesor de Bioética del presidente de Estados Unidos, que en 2005 propuso cuatro posibles alternativas White Paper Alternate Sources of Human Pluripotent Stem Cells. Washington DC. President’s Councel on Bioethics. 2005

54 ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Estas cuatro propuestas se han ampliado ocho: • Embriones en fase muy temprana de desarrollo • Estructuras biológicas no embrionarias generadas por transferencia nuclear somática alternada (ATN) • Estructuras biológicas obtenidas por transferencia nuclear somática alterada (ATN) con reprogramación asistida del ovocito (OAR)

55 ALTERNATIVAS AL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS • Por fusión de núcleos de células somáticas adultas con células madre embrionarias • De pseudoembriones • De células madre germinales • De ovocitos activados por partenogénesis • Por reprogramación de células somáticas adultas

56 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE CÉLULAS DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO

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58 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO Los primeros en proponer esta técnica fueron Strelchenko y col, del Instituto de Genética Reproductiva de Chicago, dirigido por Verlinsky, que las obtuvieron de embriones de 60 a 70 células, es decir solamente un día antes de que el embrión llegara a la fase de blastocisto N. Strelchenko y col. Reproduction BioMedicine Online 9; 623-629, 2004

59 OBTENCIÓN DE CÉLULAS TRONCALES DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO Posteriormente Robert Lanza y colaboradores de la Advanced Cell Technology, consiguen extraer blastómeros de embriones de ocho células y a partir de ellos generar líneas celulares que pudieron diferenciarse a células de distintos tejidos Los embriones de siete células resultantes se implantaron en hembras subrrogadas pseudogestantes, obteniendose ratones aparentemente normales, con una eficiencia similar a cuando se obtenían a partir de embriones de 8 células Cheng Y. y col. Nature 439; 216-219, 2006

60 OBTENCIÓN DE CÉLULAS TRONCALES DE EMBRIONES EN FASE MUY TEMPRANA DE DESARROLLO • Los embriones donantes proceden de los sobrantes de la fecundación in vitro. Por ello, las células madre así obtenidas podrían ocasionar problemas de rechazo inmunológico similares a los de los trasplantes alogénicos si se utilizaran con fines terapéuticos • Estas células tendrían por tanto una aplicación fundamentalmente experimental DIFICULTADES TÉCNICAS

61 GENERACIÓN DE ESTRUCTURAS BIOLÓGICAS NO EMBRIONARIAS POR TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT)

62 TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA Célula de tejido adulto Célula genéticamente modificada MODIFICACIÓN GENÉTICA Ovocito Ente biológico no embrionario Células similares a las células madre embrionarias ACTIVACIÓN Pseudoembrión

63 UTILIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT) La ANT fue propuesta por William B Hurlbut, de la Universidad de Stanford Perspectives in Biology and Medicine 48; 211-228, 2005

64 UTILIZACIÓN DE LA TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT) La propuesta teórica de Hulburt fue llevada a la práctica por A. Meissner y R. Jaenish En sus experiencias utilizaron fibroblastos de ratones que modificaron genéticamente para que no pudieran expresar el gen Cdx2 que produce un factor de trascripción necesario para que se forme adecuadamente el trofoblasto Si este gen no se expresa el embrión, en teoría, no podría implantarse Nature 439; 212-215, 2005

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66 TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA (ANT) DIFICULTADES ÉTICAS DE LA TRANSFERENCIA 1. No se tiene la certeza de que el gen Cxd2 cumpla la misma función en humanos que en ratones 2. No se puede tener la seguridad de que cada una de las entidades biológicas creadas sea incapaz de desarrollar un embrión viable 3. No se puede tener la certeza de que durante los tres o cuatro primeros días de vida esa entidad biológica no sea diferente de un embrión humano creado in vitro por transferencia nuclear somática 4. Necesidad de utilizar un gran número de ovocitos humanos Solter D. N. Engl. J. Med. 353; 2321-2323, 2005

67 CREACIÓN DE ESTRUCTURAS BIOLÓGICAS PSEUDOEMBRIONARIAS POR TRANSFERENCIA NUCLEAR SOMÁTICA ALTERADA CON REPROGRAMACIÓN ASISTIDA DEL OVOCITO (ANT - OAR)

68 ANT - OAR Resto celular Núcleo genéticamente modificado TRANSFERENCIA NUCLEAR Ovocito enucleado Ente biológico embrionario ACTIVACIÓN Pseudoembrión Células madre similares a las embrionarias Célula de tejido adulto

69 CREACIÓN DE ESTRUCTURAS BIOLÓGICAS PSEUDOEMBRIONARIAS POR FUSIÓN DE LAS CÉLULAS SOMÁTICAS ADULTAS GENÉTICAMENTE MODIFICADAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

70 FUSIÓN CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Para solventar el grave problema del uso de ovocitos humanos que la ANT y la ANT- OAR tienen, se propuso fusionar el núcleo de las células somáticas adultas genéticamente modificadas con células madre embrionarias en lugar de transferirlas a ovocitos enucleados

71 EXPERIENCIAS DE COWAN Y COLABORADORES Célula madre embrionaria Célula adulta genéticamente modificada ACTIVACIÓN Híbrido Células pluripotentes FUSIÓN FUSIÓN DE NÚCLEOS DE CÉLULAS ADULTAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

72 FUSIÓN DE NÚCLEOS DE CÉLULAS ADULTAS CON CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS Esta propuesta ha sido aplicada en humanos, fusionando el núcleo de células somáticas con células troncales embrionarias Tras la fusión se ha conseguido que el genoma de las células somáticas se reprogramara hasta un estado evolutivo similar al de las células pluripotentes, a partir del cual se pudieron obtener líneas celulares similares a las embrionarias Cowan CA. Science 309; 1369-1373, 2005

73 DIFICULTADES TÉCNICAS Dificultades técnicas: • Por ser células tetraploides no podrían ser utilizadas con fines terapéuticos • Para hacerlas terapéuticamente útiles habría que desarrollar un método para convertir la célula tetraploide en diploide B.M. Kuehn. JAMA; 1475-1476, 2005 • Actualmente es posible una eliminación selectiva de algunos cromosomas derivados de las células madre embrionarias pero parece difícil generar células diploides reprogramadas por este mecanismo debido al riesgo de producir inestabilidad genómica • Por la baja eficiencia del proceso de fusión ha sido difícil estudiar los mecanismos responsables de la reprogramación de la célula somática H. Matsumura y col. Nature Methods 4; 23-25, 2007 R. Jaenisch y R. Young. Cell 132; 567- 582, 2008

74 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES

75 EMBRIONES ANEUPLOIDES PARTENOTES ANDROGENOTES PSEUDOEMBRIONES

76 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES De embriones aneuploides se pueden obtener células madre de tipo embrionario normales E. Suss-Toby y col. Human Reproduction 19; 670 – 675, 2004

77 • Se consigue generar blastocistos a partir de partenotes humanos OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PARTENOTES • Los partenotes se producen por activación de ovocitos sin el material cromosómico procedente de los espermatozoides • De ellos se pueden obtener células madre embrionarias que podrían tener un hipotético papel terapéutico Editorial. Cloning and Stem Cells 9; 291, 2007 JB Cibelli y col. Journal of Regenerative Medicine 2; 25-31, 2001

78 fg fg Parthenote (only maternal genome) (in mice) can develop only till day 12, exhibiting heart beating and blood circulation Androgenote (only paternal genome) Can implant, but produces a hydatiform mole without proper embryo Tomado de: A. Suárez, M. Lang y J. Huarte (www.embryoperson.org) Febrero 2006 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE A PARTIR DE PSEUDOEMBRIONES

79 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE CÉLULAS GERMINALES

80 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES Se confirma la pluripotencialidad y plasticidad de las células germinales masculinas inmaduras obtenidas de ratones adultos. Se han denominado células madre germinales multipotenciales adultas o células maGSCs Guan y col. Nature 440; 1199 – 1203, 2006

81 Neuronal differentiation of maGSCs Striated muscleNeural tissueCartilage Epithelial cell/hepatocyte differentiation Intestine tissue OBTENCIÓN DE CÉLULAS DE DIFERENTES TEJIDOS A PARTIR DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES a-c: células neurales g-i: teratomas d-f: células epiteliales hepáticas j-l: células epiteliales intestinales Guan y col. Nature 440; 1199 – 1203, 2006

82 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE CÉLULAS MADRE TESTICULARES A partir del estroma testicular se pueden obtener células progenitoras de las espermatogonias (SPCs) y de las SPCs se pueden derivar células madre adultas multipotentes (MACs) A partir de las células MACs obtienen células cardíacas contráctiles y trasplantándolas a un animal vivo, vasos sanguíneos funcionantes M. Seandel y col. Nature 449; 346 – 350, 2007

83 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE OVOCITOS NO ACTIVADOS

84 OVOCITO NO ACTIVADO BLASTOCISTO CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS HUMANAS CÉLULAS DE DIVERSOS TEJIDOS ACTIVACIÓN (PARTÉNOGÉNESIS) OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE OVOCITOS NO ACTIVADOS E. Revazova y col. Cloning and Stem Cells 9; 432-450, 2007

85 Esta técnica también ha sido utilizada en ratonas evitando el rechazo inmunológico K. Kim. Science 315; 482-486, 2007 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS A PARTIR DE OVOCITOS NO ACTIVADOS

86 LIMITACIONES OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIASA PARTIR DE OVOCITOS NO ACTIVADOS Se requiere utilizar un gran número de ovocitos humanos Sólo podría utilizarse para tratar a mujeres

87 Para evitar el uso de ovocitos se podrían utilizar ovocitos creados in vitro, lo cual ya se ha logrado a partir de células madre de embriones de ratón o de células madre de piel de fetos de cerdo OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS EMBRIONARIASA PARTIR DE OVOCITOS NO ACTIVADOS 1 2 1. K Hulner y col Science 300; 1251-1256, 2003 2. P W Dyce y col Nature Cell Biology 8; 384-390, 2006

88 OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARES A LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS POR REPROGRAMACIÓN DIRECTA DE CÉLULAS ADULTAS

89 CÉLULAS MADRE. PASADO Y FUTURO PASADO FUTURO Cultivan por primera vez células madre embrionarias humanas Obtienen células similares a las embrionarias por reprogramación de células adultas. Nacen las células iPS Shinya Yamanaka 2006 James Thomson 1998 2007 Obtienen células iPS humanas

90 Célula adulta Célula pluripotente Células de todo tipo de tejidos REPROGRAMACIÓN REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS Célula totipotente Embrión OBTENCIÓN DE CÉLULAS MADRE SIMILARESA LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS POR REPROGRAMACIÓN DIRECTA DE CÉLULAS ADULTAS

91 CÉLULAS ADULTAS CÉLULAS SIMILARES A LAS EMBRIONARIAS (CÉLULAS iPS) CÉLULAS DE TODO TIPO DE TEJIDOS Genes codificadores de proteínas de transcripción Proteínas de transcripción Genes reprogramadores REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS ANIMALES K. Takahashi y S. Yamanaka. Cell 126; 652-655, 2006

92 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS A UN ESTADO PLURIPOTENTE Célula somática Oct4 Sox2 c-Myc Klf4 Proceso de reprogramación Reprogramada parcialmente Reprogramada totalmente Célula pluripotente Fbx15 NanogOct4 No expresan Oct4 y Nanog endógenos No generan chimeras Producen teratomas Expresan Oct4 y Nanog endógenos Modificado de: R. Jaenisch y R. Young Cell 132; 567-582, 2008

93 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS ANIMALES K. Okita y col. Nature 448; 313-317, 2007 Estos resultados fueron ampliados y confirmados en un trabajo posterior del mismo grupo. Además, si las células iPS se inyectaban en blastocistos murinos se consiguían quimeras adultas de ratones que eran capaces de transmitir sus características genéticas a la siguiente generación

94 Confirman las experiencias realizadas en animales por Takahashi y Yamanaka M. Wernig y col. Nature; 318-324, 2007 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS ANIMALES Confirman las anteriores experiencias y además consiguen producir quimeras que si son inyectadas en blastocistos murinos pueden generar embriones vivos N. Maherali y col. Cell Stem Cell 1; 55-70, 2007

95 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS Pero el paso de las experiencias animales a humanos no parecía fácil Así, Janet Rossant se preguntaba el pasado mes de julio: “¿Serán eficientes los mismos mágicos factores moleculares para generar células iPS humanas? Diversos grupos están intentándolo, pero trasladar estas pruebas a humanos tiene muchas dificultades” J. Rossant. Nature 448; 260-262, 2007

96 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS EXPERIENCIAS DE LOS GRUPOS DE SHINYA YAMANAKA Y JAMES THOMSON

97 CÉLULAS MADRE. PASADO Y FUTURO PASADO FUTURO Cultivan por primera vez células madre embrionarias humanas Obtienen células similares a las embrionarias por reprogramación de células adultas. Nacen las células iPS Shinya Yamanaka 2006 James Thomson 1998 2007 Obtienen células iPS humanas

98 CÉLULAS DE PIEL HUMANA CÉLULAS iPS GENES REPROGRAMADORES CÉLULAS DE TODO TIPO DE TEJIDOS REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS J. Yu y col. (grupo Thomson). Science 318; 1917-1920, 2007 K. Takahashi y col. (grupo Yamanaka). Cell 131; 861-872, 2007

99 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS Takahashi y col. (grupo Yamanaka): Genes reprogramados: Oct ¾, Sox2, c-Myc y Klf4 Medio para transferirlos: retrovirus Fuente de células adultas: prepucio de recién nacido Yu y col. (grupo Thomson): Genes reprogramados: Oct ¾, Sox2, Lin 28 y Nanong Medio para transferirlos: lentivirus Fuente de células adultas: fibroblastos fetales y neonatales

100 Las células iPS generadas muestran expresión genética y modelos de metilación muy parecidos a los de las células madre embrionarias, crecen internamente mientras expresan telomerasa, tienen un cariotipo normal y forman teratomas si se trasplantan a ratones inmunosuprimidos Ch.E. Murry y G. Keller. Cell 132; 661-680, 2008 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS

101 I-H. Park y col. (grupo de G.Q. Daley) Derivan células iPS de células adultas, especialmente fibroblastos de fetos neonatos y sujetos adultos, utilizando los cuatro mismo genes reprogramadores. Comprueban que los factores de reprogramación fundamentales son el Oct-4 y el Sox2. Las células iPS se asemejan a las embrionarias humanas en morfología y expresión genética y tienen la capacidad de producir teratomas en ratones inmunodeficientes CONFIRMACIÓN DE LAS EXPERIENCIAS DE YAMANAKA Y THOMSON REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS I-H. Park. Nature 451; 141-146, 2008

102 Consiguen generar células iPS a partir de fibroblastos de piel humana que pueden diferenciarse a todo tipo de tejidos, lo que avala su pluripotencialidad WE Lowry y col. PNAS 105; 2883-2888, 2008 REPROGRAMACIÓN DE CÉLULAS ADULTAS HUMANAS

103 UTILIDAD EXPERIMENTAL DE LAS CÉLULAS iPS Las células iPS podrían suplir mucha de la información que ahora proporcionan las células madre embrionarias en investigación y en medicina MF Pera Nature 451; 135-136, 2008

104 El grupo de Yamanaka demuestra que las células iPS pueden ser directamente derivadas a cardiomiocitos y células neuronales UTILIDAD EXPERIMENTAL K. Takahashi y col. Cell 131; 861 – 872, 2007

105 CLONACIÓN DE ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS Estos ratones tienen tres progenitores biológicos: el macho que aporte el esperma y la hembra que da el óvulo para la generación del embrión de ratón por fecundación in vitro y el tercer ratón del que se extrae la célula de piel con que se generaran las células iPS S Connor The independent 14-IV-2008. Experiencias del grupo de Robert Lanza de Advanced Cell Technology

106 . . . Reprogramar Fibroblasto Células iPS Clon parcial Clon completoCélula iPS Embrión de ratón Fusión CLONACIÓN DE ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS S Connor The independent 14-IV-2008. Experiencias del grupo de Robert Lanza de Advanced Cell Technology

107 Consiguen mejorar los síntomas clínicos de ratones con anemia falciforme utilizando células iPS Los tres animales que las recibieron sobrevivieron más de 20 semanas, mientras los que no, murieron antes de la séptima semana EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS EN ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS J. Hanna y col. Science 318; 1920 – 1923, 2007

108 • Demuestran que células iPS se pueden diferenciar en células madre precursoras neurales que en cultivo puede generar células neurales o de glia • Si las células generadas se transfieren al cerebro de fetos de ratones, migran a distintas regiones y se diferencian en glia y neuronas • También las células iPS se diferencian a neuronas dopaminérgicas • Cuando las neuronas dopaminérgicas se transplantan a cerebro de ratas con Parkinson se consigue mejorar sus síntomas clínicos • Estos resultados demuestran el potencial terapéutico de células iPS procedentes de fibroblastos para el reemplazo de células neuronales patológicas en un modelo animal M Wernig y col PNAS 105; 5856-5861, 2008 (publicado 15-IV-2008) EXPERIENCIAS PRECLÍNICAS EN ANIMALES UTILIZANDO CÉLULAS iPS

109 OTRAS APLICACIONES DE LAS CÉLULAS iPS • Las células iPS pueden ser el más práctico y eficiente camino para producir grandes bancos de células humanas pluripotentes de los haplotipos deseados • Esto evitaría el uso y destrucción de miles de embriones MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008

110 VENTAJAS ÉTICAS NO SE REQUIERE LA DESTRUCCIÓN DE EMBRIONES HUMANOS

111 RAZONES DE YAMANAKA PARA SUS INVESTIGACIONES • “Cuando vi el embrión, rápidamente me di cuenta de que no había diferencia entre él y mis hijas” • “Pensé que no podemos permitirnos destruir embriones para nuestras investigaciones” • “Tiene que haber otro camino” M Fackler “The New York Times” 11-XI-2007

112 VENTAJAS TÉCNICAS • No inducen rechazo inmunológico Lo que abre la posibilidad de crear fármacos específicos para un paciente determinado • No requiere la utilización de ovocitos humanos • Facilidad técnica • Coste reducido

113 INCONVENIENTES TÉCNICOS • Posibilidad de transmisión de enfermedades virales • Posibilidad, aunque menor, de producir tumores • Posibles problemas genéticos debido a la introducción del ADN de los genes reprogramadores

114 OTROS INCONVENIENTES TÉCNICOS Los actuales protocolos para generar células iPS tienen el peligro de facilitar una integración genómica aleatoria y el riesgo de ocasionar mutagénesis Además, aunque los genes reprogramadores son generalmente silenciados después de la reprogramación, la activación epigenética del Oct-4 y Sox2 podría inducir efectos no deseados en las células iPS transferidas MF Pera y K Hasegawa Nature Biotechnology 26; 59-60, 2008

115 Técnicos: • Sustituir los vectores virales • Sustituir el oncogén c-Myc Biológicos: • Conocer mejor los mecanismos de la reprogramación celular, especialmente si es debida a modificaciones epigenéticas o a modificaciones genéticas todavía no identificadas PROBLEMAS A RESOLVER J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007

116 • Un aspecto crucial es establecer qué genes son suficientes y necesarios para la reprogramación y son requeridos para inducir la proliferación de las células generadas • Parece ser que los genes Oct-4 y Sox2 son los necesarios para la reprogramación MF Pera Nature 451; 135-136, 2008 PROBLEMAS A RESOLVER

117 El mismo grupo de Yamanaka, en el reducido tiempo de tres meses consigue reprogramar hepatocitos y células de epitelio de mucosa gástrica sin utilizar el c-Myc, tanto en humanos como en ratones, sin que se generaran tumores PROBLEMAS RESUELTOS N. Nakagama y col. Nature Biothecnology 26; 101-106, 2008

118 También comprueban que al reprogramar células de estómago e hígado murinas, utilizando retrovirus, estos no penetran en la célula adulta a reprogramar y por tanto no alteran su genoma PROBLEMAS RESUELTOS T. Aoki y col. Science: DOI 10.1126 / science 1154884 (14 – 2 – 2008)

119 A la vista de las anteriores experiencias J. Cibelli se preguna: “¿Será la clonación humana con fines terapéuticos necesaria?” “La respuesta inmediata es no. Es cuestión de tiempo el que todas las hipotéticas ventajas de la clonación terapéutica puedan mejorarse utilizando células iPS” J. Cibelli. Science 318; 1879, 2007

120 ¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS? • Sería un importante error llegar a la conclusión de que la obtención de las células iPS evita la necesidad de usar células madre embrionarias • D Melton: Es prematuro afirmar esto • GQ Daley: En el momento actual no estamos seguros de que las células iPS sean absolutamente equivalentes a las células madre embrionarias • K Egan: Para estar seguro de la utilidad de las células iPS se necesita hacer un gran número de experiencias con células iPS de diferentes individuos y compararlos con células madre embrionarias C Holden y G Vogel Science319; 560-563, 2008 I Hyun y col. Cell Stem Cell 1; 367-368, 2007

121 La investigación con células iPS debería continuar junto con la investigación con células madre embrionarias I-Hyun Park. Hastings Center Report 38; 20-22, 2008 ¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS? BM Kuehn JAMA 299; 26, 2008

122 Sin embargo la gran mayoría de los investigadores que trabajan en este campo creen que las células iPS sustituirán con ventaja a las células madre embrionarias, tanto con fines experimentales como terapéuticos ¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS?

123 CONSECUENCIAS DEL DESCUBRIMIENTO DE LAS CÉLULAS iPS Es este un gran avance experimental, que hay que saludar como una gran esperanza para encontrar caminos éticos que permitan el desarrollo que la medicina reparadora y regenerativa requiere

124 Sin embargo la gran mayoría de los investigadores que trabajan en este campo creen que las células iPS sustituirán con ventaja a las células madre embrionarias, tanto con fines experimentales como terapéuticos ¿PUEDEN LAS CÉLULAS iPS HACER INNECESARIO EL USO DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS?

125 Por ello, Ian Wilmut el creador de la oveja Dolly, manifiesta que abandona la clonación para utilizar las células iPS Y el propio James Thomson comentaba (Gina Kolata. The New York Times, 22/11/2007) que probablemente “dentro de una década la guerra de las células madre embrionarias será solo una nota al pie de una página curiosa de la historia de la ciencia” CONSECUENCIAS DEL DESCUBRIMIENTO DE LAS CÉLULAS iPS R Highfield Daily Telegraph ( http://www.telegraph.co.uk) 16-XI-2007

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