Caspase activation, sialidase release and changes in sialylation pattern of recombinant human erythropoietin produced by CHO cells in batch and fed-batch cultures (revisión)

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Published on March 19, 2014

Author: manuelgug

Source: slideshare.net

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Revisión del artículo "Caspase activation, sialidase release and changes in sialylation pattern of recombinant human erythropoietin produced by CHO cells in batch and fed-batch cultures" de Kok Hwee Chuan, Sing Fee Lim, Laurent Martin, Chee Yong Yun, Sophia O. H. Loh, Francoise Lasne y Zhiwei Song.

Caspase activation, sialidase release and changes in sialylation pattern of recombinant human erythropoietin produced by CHO cells in batch and fed- batch cultures Kok Hwee Chuan, Sing Fee Lim, Laurent Martin, Chee Yong Yun, Sophia O. H. Loh, Francoise Lasne, Zhiwei Song. Cytotechnology (2006) 51:67–79 Manuel García Ulloa Gámiz

Caspasas Familia de proteasas iniciadoras/ejecutoras de la apoptosis.

Apoptosis vs Necrosis Muerte celular en biorreactores. Necrosis Apoptosis (más común) Ruptura física de la célula por agitación/aireación excesivas. Falta de nutrientes, hipoxia, acumulación de residuos, alta osmolalidad. Liberación de contenidos celulares al medio. Posible daño al producto.

Ácido siálico Monosacárido de 9 carbonos empleado en la glicosilación.

Sialidasa

Objetivo • Establecer una relación entre la activación de caspasas, la expulsión de sialidasas y lactato deshidrogenasa (LDH)* y los cambios en patrones de sialilación en EPO recombinante humana. *Se utiliza LDH debido a su fácil medición; de haber una correlación fuerte entre LDH y muerte celular, podría ser utilizada como un indicador confiable.

Materiales y Métodos • Cultivo de células CHO: batch y fed-batch. – Biorreactores de 2 litros – 110 rpm – 37ºC – 7.1 pH • Medición de viabilidad y densidad celular: Cedex (tinción azul). • Concentración de EPO: ELISA. • Actividad de sialidasas y caspasas: medición de fluorescencia emitida por sustrato artificial cada 2 mins. • LDH: kit de detección citotóxica. • *Caspasa-3: Western Blot. • Detección de isoformas de EPO: enfoque isoeléctrico.

Resultados

A. Cultivo Batch. B. Cultivo Fed-Batch. Punto negro: densidad celular; Círculo: viabilidad celular; Todos los demás: caspasas. Viabilidad celular vs activación de caspasas

Batch Fed-Batch Western Blot de Caspasa-3

Círculo: viabilidad celular; Triángulo: LDH; Cuadrado: sialidasa. A. Cultivo Batch. B. Cultivo Fed-Batch. Relación entre liberación de sialidasa y LDH

A. Cultivo Batch. B. Cultivo Fed-Batch. Círculo: viabilidad celular; Punto negro: EPO; Cuadrado: caspasa-3. Relación entre viabilidad celular, producción de EPO y actividad intracelular de caspasa-3.

Cambios en patrones de sialilación en la EPO Enfoque isoléctrico. Espectro de intensidad de bandas AIDA 1-D.

Perfil de sialilación vs viabilidad celular Triángulo banco: sialilación en batch; Cuadrado blanco: sialilación en fed-batch; Triángulo negro: viabilidad en batch; Cuadrado negro:viabilidad en fed-batch.

Conclusiones/Discusiones • La actividad máxima de las caspasas está directamente relacionada a la pérdida de viabilidad celular. • Las razones de la activación de la apoptosis posiblemente son distindas en batch y fed-batch; en fed-batch no hay carencia de nutrientes. • Hay correlación entre actividad de sialidasas con desialilación de EPO recombinante humana. • En cultivo fed-batch, la desialilación ocurrió incluso antes de que la actividad de las sialidasas fuera considerable; existen otros factores desconocidos. • Aumento de LDH puede ser utilizado como indicador de apoptosis en biorreactores.

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