biologia molecular en oncohematologia

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Published on December 10, 2008

Author: mateixtus

Source: authorstream.com

BIOLOGIA MOLECULAR EN ONCOHEMATOLOGIA : BIOLOGIA MOLECULAR EN ONCOHEMATOLOGIA Bioquimico Roberto Carlos Amadio SIRUS Hospital del niño Jesus Slide 2: DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENETICAS Detección del gen responsable: ausencia del gen defecto causado por deleción defecto causado por una mutación puntual defecto causado por translocación defecto causado por incremento de trinucleótidos repetitivos Diagnóstico Molecular : Diagnóstico Molecular Ribotyping Restriction fragment length polymorphism (RFLP) DNA hybridization PCR, RT-PCR, RAPD Secuenciamiento de ácidos nucleicos Slide 4: Prenatal Pre-sintomático En tiempo real (monitoreo) DIAGNOSTICO MOLECULAR : Tres niveles Slide 5: Gel Electrophoresis Slide 7: Southern Blot Analysis Slide 9: Gene ass (65Kb) Gene abl (225 Kb) 1b 1a 2...............................11 650 Kb FISH -Núcleos interfásicos -Sonda locus específica con señal extra -Punto de ruptura m-bcr y M-bcr Sonda abl Sonda bcr 300 Kb e1 e2 e3...............................12 13 14 3´ 5´ m-bcr M-bcr Slide 10: Laboratorio de Biología Molecular Area Pre-Amplificación -Procesamiento de la muestra -Extracción de Ac. Nucléicos -Síntesis de ADNc -Preparación de los mix de PCR Area de Amplificación -Reacción de PCR -Electroforesis en gel de agarosa -Reacción de secuenciación Recolección de Muestras : Recolección de Muestras Muestra Diagnóstica: Antes de iniciar cualquier tratamiento Médula ósea. La opción de SP sólo con WBC>100.000/mm3 (80% blastos) MO “Dry-tap”, remitir junto con SP Anticoagulante de elección EDTA dipotásico (1:10 ml) 5-10 ml de muestra No utilizar heparina Procesamiento de muestras : Procesamiento de muestras Procesamiento de muestrasDiagnóstico : Procesamiento de muestrasDiagnóstico Procesamiento de muestras Seguimiento : Procesamiento de muestras Seguimiento Slide 15: RT - PCR 5’ 3’ mRNA 5’ 3’ cDNA 5’ 3’ Transcripción Reversa 5’ 3’ 1er. Ciclo 2do. Ciclo 3er. Ciclo n Ciclos 2n Copias PCR Slide 16: Nested-PCR b2 b3 a2 e11 bcr abl b2a2/b3a2 Amplificación del ADNc bcr-abl Slide 17: Visualización en gel de agarosa de la expresión del gene quimérico bcr-abl Slide 18: Controles del PCR Controles Positivos Se utilizan como controles positivos de la reacción de PCR: -ADNc de línea celular K562 -ADNc de paciente (+) b2a2 Control de calidad del ADNc sintetizado - PCR múltiple para bcr, abl, 2-mg, pbgd Control de falsos positivos a) Areas independientes de trabajo b) PCR en nido Cámara UV c) Se utilizan como mínimo 2 controles negativos: de amplificación y de expresión Pre-amplificación Post-amplificación Slide 19: PCR Múltiple para los genes: bcr, abl, 2-mg y pbgd Diferencia ADNc de ADNg (banda de 793 pb) bcr 2-mg abl pbgd Slide 20: Sensibilidad de la técnica de PCR para bcr-abl 1er. PCR: 1x10 -4g de ADNc 2do. PCR: 1x10 -6 g de ADNc -se realizaron diluciones seriadas del ADNc de K562 a las cuales se les realizó el PCR en nido para bcr-abl Slide 21: *Ventajas Técnicas Moleculares de Diagnóstico -alta sensibilidad -alta especificidad -Permite diagnóstico, pronóstico y seguimiento -rápido -permite el diagnóstico en casos con cariotipo normal -Permite diferenciar los diferentes puntos de ruptura en el gene bcr, lo que se encuentra asociado a distintos tipos de patologías Slide 22: Otras patologías estudiadas por PCR: -LAL: gene mll-af4; bcr-abl -LPA-M3: gene pml-rar -LPA-M2: gene aml1-eto -LNH: gene bcl2-Igh Enfermedad minima residual (B.M) : Enfermedad minima residual (B.M) Estructura de Ig y TCR : Estructura de Ig y TCR Slide 25: Estructura de Igs y TCR TCR Delta : TCR Delta van Dongen JJM, et al. Leukemia (2003) 17, 2257-2317 TCR Gamma : TCR Gamma van Dongen JJM, et al. Leukemia (2003) 17, 2257-2317 Procesamiento de muestras : Procesamiento de muestras Médula Ósea ó Sangre Periférica Separación de Mononucleares Extracción de ADN PCR Gen control de integridad PCR para Ig y TCR PCR-HDX-Seq : PCR-HDX-Seq Slide 31: van Dongen JJM, et al. Leukemia (2003) 17, 2257-2317 Slide 32: van Dongen JJM, et al. Leukemia (2003) 17, 2257-2317 Caracterización del producto de PCR : Caracterización del producto de PCR IMGT/V-QUEST: http://imgt.cines.fr/ (Giudicelli V. et al. Nucl. Acids Res. 2004, 32, W435) Caracterización del producto de PCR : IMGT/V-QUEST: http://imgt.cines.fr/ (Giudicelli V. et al. Nucl. Acids Res. 2004, 32, W435) Caracterización del producto de PCR Slide 35: Caracterización de Ig/TCR Los rearreglos son paciente-específicos Herramienta valiosa, sensible, específica Aplicable a ~ 95% de LLA Sumamente laborioso Necesita un laboratorio debidamente equipado Necesita personal especialmente preparado Posibilidad de evolución clonal Fin…… : Fin……

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