Biología molecular aplicada a inmunohematología

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Health & Medicine

Published on September 23, 2014

Author: Trishdeish

Source: slideshare.net

Biología Molecular aplicada a Inmunohematología Patricia Peralta Moncada Universidad de Chile

Temas a tratar • Introducción. • Utilidades de las técnicas moleculares en inmunohematología. • Técnicas utilizadas. • Revisión rápida de un trabajo de investigación. • Conclusiones.

Introducción • La hemaglutinación ha permitido el desarrollo y la práctica de la medicina transfusional durante el siglo XX. • La reacción entre los antígenos eritrocitarios y los anticuerpos (suero de pacientes o reactivos comerciales) es la base de las técnicas en inmunohematología: • Determinación de grupoABO, Rh. • Determinación de antígenos de significancia clínica (Kell, MNS, Kidd, Duffy) • Detección de anticuerpos irregulares. • Pruebas de compatibilidad. • Limitaciones: • Fenotipo de pacientes politransfundidos. • Fenotipo de pacientes conGR recubiertos de Ig. • Identificación de variantes. • Discrepancias. • Falta de reactivos para detección de algunos antígenos. • Dificultad para crear paneles de detección e identificación de anticuerpos irregulares.

Introducción • Las técnicas que involucran al ADN han llevado a entender las bases moleculares de muchos de los sistemas sanguíneos. • Existen muchos eventos moleculares que llevan a la formación de antígenos distintos, y por ende, fenotipos distintos. • La mayoría son consecuencia de SNPs (single-nucleotide polymorphism). Eventos moleculares que llevan a antígenos y fenotipos de los grupos sanguíneos Conversión genética o eventos de recombinación (MNSs, Rh, Ch/Rg) Duplicación de un exón (Gerbich) Deleción de un gen, exón o nucleótidos (ABO, Rh, MNS, Kel, Duffy, Dombrock) Inserción de nucleótido (s) (Rh, Colton) Sustituciones de un solo nucleótido SNPs (La mayoría) Las técnicas moleculares aprovechan esto para la Genotipificación

Utilidades Pacientes con transfusiones múltiples • Como complemento a la investigación serológica. • Se recomienda la genotipificación en pacientes con múltiples transfusiones como parte del proceso de identificación de anticuerpos. • Particularmente útil en pacientes dependientes de transfusiones que han producido aloanticuerpos. Pacientes con GR recubiertos de IgG (AHAI) • No pueden ser fenotipificados de manera exacta la mayoría de las veces. • Mejoraría la posibilidad de encontrar unidades compatibles.

Utilidades Donantes • Para posibles transfusiones de la unidad (búsqueda de unidades antígeno negativos). • Para crear paneles de células para búsqueda de anticuerpos irregulares. Resolución de discrepancias • D débil y parcial • DiscrepanciasABO Materno-fetal • Para prevención de EHRN (por incompatibilidad Rh). • DNA fetal se puede obtener a partir de células amnióticas, muestras de vellosidades coriónicas y de plasma materno.

Técnicas moleculares para el análisis genético de grupos sanguíneos. • Amplificación de ADN por PCR • PCR-alelo-especifico • PCR-RFLP • PCR-multiplex • Secuenciación • Real time PCR • Microarray Complementarias o independientes.

PCR convencional • Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase Chain Reaction). • 3 procesos que se repiten por cada ciclo: 1. Denaturación 2. Apareamiento 3. Extensión • Basado en las características de los ácidos nucleicos: 1. Mimetiza el proceso de replicación del ADN. 2. Capacidad de separarse (denaturación) y volver a hibridarse (renaturación). 3. Complementariedad de bases (A=T; G=C). • Equipo: Termociclador. • Detección: Electroforesis en gel de agarosa con tinción (Bromuro de etidio, GelRed)

PCR convencional

PCR Alelo Específico • Uso de partidores secuencia específica. • Permite la identificación de secuencias específicas para identificar distintos alelos de un gen. Mixes de reacción pre-alicuotados basados en PCR - Sequence Specific Primers (SSP). Genotipificación rápida. Complemento a tipificación serológica.

PCR-RFLP • RFLP: Restriction Fragment Lenght Polymorphysm. • Tratamiento del DNA amplificado por PCR o tratamiento del DNA a amplificar con enzimas de restricción para generar cortes en secuencias específicas. • Se obtiene un patrón de bandeo dependiendo de los cortes realizados por las enzimas. Ejemplo: “How do we identify RHD variants using a practicalmolecular approach?” Fenotipo D Polimorfismo relacionado D débil tipo 1 809T>G; ApaLI D débil tipo 2 1154G>C; AluI D débil tipo 3 8C>G; SacI DAR-1 957G>A; BseYI

PCR-multiplex • Amplificación de la muestra de ADN utilizando varios sets de primers a la vez, en un mismo mix de reacción, que son específicos para diferentes regiones de la secuencias deADN. • Para la detección por electroforesis, se debe tener en cuenta el diseño de los partidores para obtener productos de diferentes tamaños. High-throughputmultiplex PCR genotyping for 35 red blood cell antigens in blood donors

Real Time PCR • Variante de la PCR convencional en la cual se puede cuantificar el producto simultáneamente a su amplificación (Detección en tiempo real del producto). • Se distinguen entre sí por el método de detección: • Fluorocromo no específico: • SYBR Green (se une a cualquier molécula de ADN). • Fluorocromo específico (sonda): • Sondas TaqMan • Sondas Molecular Beacons • Sondas Scorpion • Se cuantifica la fluorescencia emitida

Real Time PCR CT: Ciclo Umbral (Threshold cycle): Nº de ciclo donde la señal cruza el umbral de detección

Secuenciación • Técnica mediante la cual se logra conocer la secuencia nucleotídica de la porción de ADN a analizar. • La gran mayoría está basado en el método de Sanger y Rapley. ¿Cuándo secuenciar? Serología Genotipificación Secuenciación

Microarrays • Chip de DNA: Son una colección de sets de fragmentos de ADN adheridas de forma ordenada a una superficie sólida. • Para genotipificar múltiples regiones del genoma simultáneamente. • Se basa en la capacidad de los ácidos nucleicos de hibridar con su complementario. • Detección: marcaje de la muestra con fluorocromos, plata o quimioluminiscencia. • Análisis de datos: bioinformática. Softwares especializados para cada chip con bases de datos para generar los genotipos.

Microarrays • En una misma prueba genera sobre 3000 resultados. • Se basa en la detección de SNPs. • El DNA genómico target aislado de sangre total se amplifica, se captura y se marca con fluorescencia por elongación en sondas alelo específicas inmovilizadas en micropartículas sintéticas. La fluorescencia de cada perla se analiza en el Array Imaging System (AIS). El software BioArray Solutions Information System (BASIS) calcula y ajusta la intensidad de cada reacción para asignar un genotipo y predecir un fenotipo para cada polimorfismo.

Microarrays

How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? Revista Transfusion, volumen 54, Abril de 2014.

How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? Revista Transfusion, volumen Importancia: • Prevenir la aloinmunización en receptores. Receptor D parcial Tipificado Rh+ (Sueros clasificadores) Transfusión con Rh+ 54, Abril de 2014. Formación de anti-D Donante D débil Tipificado Rh- (Sueros clasificadores) Transfundido a receptor Rh- Formación de anti-D

How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? Estrategia: Método fácil y racional para la identificación de las variantes D más comunes usando un camino más corto y menos caro en comparación a otros métodos moleculares comerciales. Algoritmo basado en la genética molecular de RHD, polimorfismos de D, frecuencias de las D variantes en diferentes poblaciones y asociación con los alelos RHCE. (Búsqueda en bases de datos ISBT y Rhesus Site) • 360 muestras con expresión atípica del antígeno D (Reactividad menor de 3+ en la tipificación D). • PCR multiplex basado en Genotyping of RHD by multiplex polymerase chain reaction analysis of six RHD-specific exons (Maaskant-van Wijk y cols.) • Seis sets de primers específicos para la amplificación de los exones 3, 4, 5, 6, 7 y 9 del gen RHD. Adaptación: 5 sets que amplifican los exons 3, 4, 5, 7 y 9 • Localizados en las regiones donde se pueden encontrar SNPs causantes de muchos D variantes. • Basado en los resultados, combinados con la asociación a los alelos RHCE y las frecuencias de las variantes, se decide el protocolo a utilizar.

How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? 1. PCR multiplex 2. PCR-RFLP 3. Secuenciación de DNA

How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?

How do we identify RHD variants using a practical molecular approach? • PCR multiplex + 1 PCR-RFLP 84 muestras (23% ). • PCR multiplex + 2 PCR-RFLP 135 muestras (37%). • PCR multiplex + 3 o más PCR-RFLP + secuenciación de un exón 121 muestras (33%). Ventajas: • PCR multiplex + PCR-RFLP toman aproximadamente 2 horas (corto tiempo). • Más barato que microarrays o secuenciar los 10 exones. • Identificación de variantes no cubiertas en microarrays (11,6% de las muestras estudiadas). • Útil para resolver discrepancias RhD y distinguir entre D débil o parcial. • Puede ser adaptado a otras poblaciones.

Conclusiones • La existencia de las técnicas moleculares facilita la resolución de problemas que no pueden ser resueltos con la hemaglutinación. • Reactividad débil de algunos reactivos para ciertos antígenos. • Tipificación de pacientes con transfusiones recientes. • Identificación de riesgo de EHRN. • Aumentar la fiabilidad de unidades antígeno negativos para transfusión. • Llegar a un genotipo no significa necesariamente que el antígeno se va a expresar en el GR. • La mayoría de estas técnicas son muy costosas, por lo cual el enfoque que se está dando en los estudios es la creación de algoritmos de identificación para disminuir costos, manteniendo la calidad.

Bibliografía • Mariza Mota,MD,PhD. Hospital Israelita Albert Einstein – São Paulo, Brasil. 06 y 07 /10 /2011. Jornada de Hematologia y Medicina Transfusional de la Sociedad Chilena de Hematologia. ACTUALIZACIÓN EN INMUHEMATOLOGIA: NUEVAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS. Extraído de http://www.hematologia.org/bases/arch889.pdf • http://www.bag-healthcare.com/uploads/media/BAG_Broschuere_v_BAGene-01eng.pdf • ARUP Laboratories. Blood Group Microarray, Nine Blood Groups For genotyping the ABO, RhD/RhCE, Duffy, Kell, Kidd, Diego, Dombrock, Colton, and MNS blood groups. FEBRUARY 2010. • Secuenciación de ADN. Extraído de: http://pendientedemigracion.ucm.es/info/genetica/AVG/practicas/secuencia/Secuencia.htm#Metautomatico • Axel Seltsam and Andrea Doescher. Transfus Med Hemother. Sequence-Based Typing of Human Blood Groups. Jun 2009; 36(3): 204–212. Published online May 14, 2009. doi: 10.1159/000217322. Extraído de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2980529/ • BioArrayTM HEA BeadChipTM. Extended Red Blood Cell Antigen Typing by DNA Analysis. Extraído de http://www.immucor.com/en-us/Products/Documents/BioArray_HEA_SalesSheet.pdf • Castilho Lilian, Pellegrino Júnior Jordão. Blood group genotyping. Rev. Bras. Hematol. Hemoter. [serial on the Internet]. 2004 [cited 2014 Sep 15] ; 26( 2 ): 135-140. Disponible en: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-84842004000200012&lng=en. http://dx.doi.org/10.1590/S1516-84842004000200012. • Arnoni, C. P., Latini, F. R.M., Muniz, J. G., Gazito, D., Person, R. d. M., de Paula Vendrame, T. A., Barreto, J. A. and Castilho, L. (2014), How do we identify RHD variants using a practical molecular approach?. Transfusion, 54: 962– 969. doi: 10.1111/trf.12557

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