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Information about 530

Published on March 17, 2016

Author: PatrizioPanelli

Source: slideshare.net

1. Myosin IIa mediates Parkin translocation to damaged mitochondria Patrizio Panelli 5.12.2014

2. Overview about Parkinson’s disease  Named after English doctor James Parkinson (1800)  Symptoms and neuropathology are well characterized: -Tremor -Memory loss -Muscle weakness -Loss of voluntary movement -Rigidity

3. Classification (clinical) Genetic Parkinson’s diseases Genes responsible of inherited form of Parkinson’s disease: Classical Parkinsonism Early-onset Parkinsonism Atypical Parkinsonism PARKIN PINK1 DJ1 SNCA LRRK2 VPS35 ATP13A2 FBX07 DNAJC6 SYNJ1

4. Ubiquitin system E2 -SH E2 -S O Ub E3 E3 E2 E3-ubiquitin ligase O O Ub + ATP AMP + PPi | SH | S O Ub E1 E1 E1 E1- ubiquitin activation enzyme E2-ubiquitin conjugating enzyme Functions of ubiquitination : Endocytosis; trafficking; protein degradation; DNA repair Parkin may target substrates to either the proteasome or the autophagic machinery by ubiquitination.

5. Functions of Parkin Image adapted. Vives-Bauza C. Przedborski S. Cell Press (2010) Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy

6. How is parkin rectruited to damaged mitochondria ?

7. RING-between-RING E3 ligase, Parkin R Andrew Byrd and Allan M Weissman The EMBO Journal (2013) 32, 2087 - 2089 doi:10.1038/emboj.2013.158 Catalytic site Closed conformation Opened conformation E2 R42P K161N K211N T240R R256C R275W D280N C289G Q311STOP G328E R334C C352G T415N K416STOP G430D C431F M434K C441R W453STOP RING2UBL RING0 RING1 IBR REP S65A

8. Previous results

9. Myosin in the human genome (Journal of the Royal Society of Chemistry) in 2009, by Michelle Peckham and Peter Knight.

10. Conventional non-muscle Myosin II Responsible for mobility and lamellipodia formation; regulates actomyosin-microtubule crosstalk cell adhesion; maintenance of cell shape ; facilitates vesicle trafficking Myosin IIa Myosin IIb Myosin IIc Myosin IIa functions: http://hypermol.com

11. Parkin & Myosin IIa interact upon mitochondria damage GFP-MYH9 Flag-Park2 WB: αFLAG WB: αGFP CCCP INPUT 1% + + + + + - IP GFP-MYH9 + + - - + + WB: αFLAG WB: αGFP

12. U2OS cells Immunofluorescence, Parkin on cytoskeleton components Mitochondria GFP-Parkin

13. GFP-Parkin colocalizes with F-Acting filament F-actin filaments GFP-ParkinMerge

14. Inhibition of Myosin II using B056 (blebbistatin) releases Parkin from F-Actin filaments DMSO B056

15. DMSO Blebbistatin

16. Hypothesis Parkin requires Myosin IIa for mitochondria translocation CCCP MYH9 F-Actin ΨParkin MYH9 F-Actin Ψ Parkin Δ

17. Parkin to mitochondria translocation upon F-actin depolymerization Colocalize Partially colocalize No colocalization N=3 MergeMitochondria (CoxIV)GFP-Parkin DMSOCCCP+Cit-DCCCP 0 20 40 60 80 100 120 DMSO CCCP CCCP+CIT-D %COLOCALIZATION A B

18. Mitochondria (CoxIV) Parkin Merge DMSO CCCP+Cit-D CCCP 00 10 20 30 40 50 60 %ofcolozalization N=3 Parkin translocation to mitochondria upon F-actin depolymerization SH-SY5Y

19. Merge Mitochodnria(COX IV) GFP-Park2 Colocalized Partially colocalized Does not colocalize 0 10 20 40 80 100 %colocalization N=3 DMSO CCCP CCCP+B056 U2OS cells Parkin to mitochondria translocation upon Myosin IIa inhibition DMSO CCCP CCCP+B056

20. Mitophagy inhibition 24h cell treatment 0 5 10 15 20 25 30 35 40 U2OS cells Percentage of cells with active mitophagy GFP-Park2 CoxIV(mitochondria) Merge DMSO CCCP+Cit-D CCCP CCCP+B056 %ofcellswithoutmitochondria

21. ΨΔ mitochondrial membrane potential ΨΔ Parkin Myosin IIa F-Actin filaments Ubiquitin Proposed Model ΨΔ WB: Myosin IIa WB: Parkin WB: Tom20 CCCP DMSO SH-SY5Y WB: GADPH

22. Future plan Assess mitophagy: Mitochondrial profile from cells treated with either Cytochalasin D or B056 Assess Pink1 recruitment: Use mitochondria fractions to test if the impairment of the cytoskeleton components affect Pink-1 enrichment Truncation of Parkin and identification of the interacting domain Myosin IIa knock down using lentiviral system Enhance Myosin IIa activities using drugs with the aim to rescue the phenotype of some Parkin mutant

23. Mayor Lab: -Prof. Mayor Thibault. -Dr. Chan Patrick -Dr. Albu Razvan -Fang Nancy -Comyn Sophie -Zhu Mang -Chan Gerard Lab Members

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